L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di aggregare e racchiudere le cellule all'interno di una matrice semisolida. Gli aggregati cellulari incorporati possono quindi essere utilizzati a valle in colture tridimensionali in vitro o come veicolo per esperimenti di trapianto in vivo. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza una metodologia e un'attrezzatura semplici per ottenere l'aggregazione cellulare.
Può anche essere applicato a una serie di tipi di cellule e numeri. Questa tecnica ha rivelato un tipo specifico di cellula necessaria per la rigenerazione della milza. Potrebbe scoprire ulteriori regolatori della rigenerazione del tessuto della milza o fungere da piattaforma per studi più ampi sull'ingegneria tissutale.
Iniziare pre-raffreddando una scatola di puntali per pipette da 200 microlitri all'interno di un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Quindi immergere Parafilm in etanolo all'80% per 10 minuti, seguito da un lavaggio di 10 minuti in PBS. Per preparare la soluzione cellulare, aliquotare il numero di cellule desiderato in una provetta conica da 14 millilitri.
Centrifugare le cellule a 200 g e 4 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante, lasciando dietro di sé circa 20 microlitri di volume. Il pellet cellulare può quindi essere risospeso nel volume di surnatante rimanente.
Utilizzando un puntale per pipette pre-raffreddato, aspirare 2 microlitri di Matrigel ghiacciato. Ruotare ed espellere delicatamente per rimuovere il puntale della pipetta. Stendere una striscia pre-sterilizzata di Parafilm e posizionarla sull'estremità del puntale della pipetta, facendo attenzione a non forare la pellicola.
Continuare ad avvolgere il Parafilm attorno al lato per assicurarsi che la punta sia sigillata. Quindi stratificare delicatamente la soluzione cellulare sul Matrigel. Lasciare il puntale della pipetta sul ghiaccio e preparare una provetta conica da 14 millilitri con una provetta a grappolo da 1,2 millilitri inserita all'interno.
Il puntale della pipetta può quindi essere inserito all'interno della configurazione a provette nidificate e centrifugato a 400 g e 4 gradi Celsius per 5 minuti. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Il tubo può essere posizionato sul ghiaccio fino a quando non è necessario ulteriormente.
Rimuovere con cautela il Parafilm dal puntale della pipetta, quindi inserire uno stantuffo a filo sottile ed espellere il tappo di Matrigel nel terreno di coltura tissutale. Le cellule aggregate possono essere coltivate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Radere il pelo con un tagliacapelli elettrico e tamponare la pelle con etanolo all'80%.
Fai un'incisione di due centimetri nella pelle perpendicolare alla colonna vertebrale ed esponi la parete peritoneale. Viene quindi praticata una seconda incisione più piccola nella parete peritoneale sopra il rene. Applicare pressione ed esternalizzare il rene.
Assicurarsi che il rene sia mantenuto umido applicando regolarmente PBS sterile. Pizzica la capsula renale con un paio di pinze ultrasottili e, usando un secondo paio, strappa delicatamente in direzioni opposte. Separare con cura la membrana della capsula dal parenchima renale.
Sollevare la capsula renale con un paio di pinze e far scorrere lentamente la punta della pipetta attraverso l'apertura. Inserire delicatamente uno stantuffo metallico nel puntale della pipetta ed espellere il tappo Matrigel. Inumidire il rene con PBS e reinternalizzarlo nella cavità peritoneale.
Chiudere la parete peritoneale con suture 5-O-Vicryl e chiudere l'incisione cutanea utilizzando un applicatore AutoClip e due clip per ferite da 9 millimetri. Un passaggio chiave in questo protocollo è l'aggregazione delle cellule all'interno di una matrice semisolida. Il posizionamento dello strato intermedio si ottiene grazie a velocità di centrifugazione ottimali.
Velocità più elevate spingono le cellule fino alla punta della pipetta, mentre velocità insufficienti impediscono il movimento delle cellule attraverso la matrice. Dopo la solidificazione, il costrutto Matrigel può essere espulso dal puntale della pipetta. I costrutti stromali della milza coltivati in vitro formano strutture organoidi sferiche tridimensionali.
Gli organoidi mostrano una struttura non cava con cellule presenti su tutto il diametro del tessuto. Sono costituiti da tre ampie popolazioni cellulari, tra cui globuli bianchi, globuli rossi e cellule stromali ed endoteliali non emopoietiche. I costrutti possono anche essere trapiantati sotto la capsula renale per studi di rigenerazione tissutale.
Dopo quattro settimane, è possibile osservare la struttura organizzata del tessuto della milza, comprese le arteriole centrali, i follicoli a cellule B, le cellule reticolari fibroblastiche, le cellule mieloidi della polpa rossa, i macrofagi metallofili della zona marginale, i sinusoidi della polpa rossa e le reti di cellule dendritiche follicolari, la zona delle cellule T, i macrofagi della polpa rossa e le cellule reticolari della zona marginale. Quando si tenta l'aggregazione e l'incapsulamento cellulare, è importante ricordarsi di lavorare rapidamente e di mantenere tutti i materiali sul ghiaccio. Il passo più importante per i trapianti è l'espulsione del tappo Matrigel mentre si preleva il puntale della pipetta dal rene.
Bisogna fare attenzione a non perforare la membrana della capsula o a non rompere il parenchima renale. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare i requisiti di due popolazioni di cellule stromali nella rigenerazione del tessuto della milza. In questo esperimento rappresentativo, solo gli aggregati impoveriti di cellule negative MAdCAM positive al recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine non sono riusciti ad avviare la crescita tissutale, suggerendo che questa particolare popolazione cellulare è essenziale per la rigenerazione della milza.
