L'iniezione di spermatidi rotondi può risolvere il problema della riproduzione in alcuni pazienti con azoospermia non ostruttiva, ma la sua efficienza è molto bassa. Il nostro studio ha utilizzato i topi come modelli per cercare metodi per migliorare l'efficienza dello sviluppo embrionale di ROSI nel topo. Una statistica incompleta indica che meno di 200 feti umani concepiti con ROSI sono stati partoriti a livello globale.
Un punto di svolta nella comprensione del potenziale della tecnologia ROSI si è verificato nel 2015, quando Tanaka e colleghi hanno riferito del successo delle nascite di 14 feti attraverso la tecnologia ROSI, infondendo rinnovata fiducia nella sua applicazione clinica e fattibilità. L'attuale focus della ricerca ROSI è sulle anomalie nelle modificazioni epigenetiche e nell'attivazione assistita da ovociti anormali, mentre anche l'identificazione accurata dei dati spermatici rotondi è una sfida. L'efficienza di sviluppo degli embrioni ROSI nel topo è già molto elevata nel nostro laboratorio, che è simile ad altri laboratori.
Tuttavia, l'efficienza di sviluppo dei non roditori, come gli esseri umani, è ancora molto nuova. In futuro, ci concentreremo sul miglioramento dell'efficienza di sviluppo dei non roditori. Per iniziare, iniettare una femmina di topo di sei-otto settimane per via intraperitoneale con 7,5 unità internazionali ciascuna di gonadotropina sierica di cavalla gravida alle 17:00 e gonadotropina corionica umana 48 ore dopo.
Assicurarsi che non si verifichi alcun contatto con topi maschi dopo l'iniezione. Dopo l'eutanasia del topo, aprire la cavità addominale. Usando le forbici, recidere le tube di Falloppio vicino a entrambe le ovaie e metterle nel tampone M2 preriscaldato a 37 gradi Celsius.
Sotto l'obiettivo 10X di un microscopio verticale, individuare la parte trasparente e ingrandita delle tube di Falloppio. Quindi, utilizzando una siringa da un millilitro, fissare le tube di Falloppio, tagliare la parte ingrandita e raccogliere i complessi del cumulo coronale dell'ovocita. Per rimuovere le cellule della granulosa, posizionare il complesso ovocitario in una soluzione operativa M2 preriscaldata contenente lo 0,1% di ialuronidasi e soffiare delicatamente attraverso una pipetta orale.
Trasferire l'ovocita in serie su goccioline KSOMaa per risciacquare tre volte e metterlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per iniziare, procurati un topo maschio C57BL/6 di età compresa tra otto e 10 settimane sottoposto a eutanasia. Aprire la sua cavità addominale e asportare delicatamente l'epididimo vicino al testicolo con le forbici.
Posizionare la capsula contenente epididimo in un terreno M2 sotto l'obiettivo 10X di un microscopio verticale. E usando una siringa da un millilitro, asportare delicatamente l'epididimo per far defluire gli spermatozoi. Aspirare gli spermatozoi che scorrono in sospensione sul fondo di una provetta contenente 0,5 millilitri di tampone M2.
Per l'isolamento rotondo dello spermatide, trasferire il testicolo sezionato nel tampone M2. Usando una siringa da un millilitro, tagliare delicatamente la membrana bianca al microscopio, quindi spremere e asportare i tubuli seminiferi contorti. Dopo aver estratto la sospensione, filtrare con un setaccio da 400 mesh e centrifugare le celle filtrate.
Scartare il surnatante e incubare le cellule con 200 microlitri di Hoechst 33342 a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare la provetta per citometria contenente le cellule colorate nel citometro a flusso. Dopo aver regolato la tensione, selezionare la popolazione di celle in base alla dispersione diretta e laterale.
Quindi, rimuovere le aderenze cellulari in base alla dispersione diretta e all'ampiezza dell'impulso di trigger. Utilizzando due canali di rilevamento sotto un laser con lunghezza d'onda di 355 nanometri, ordina gli spermatidi rotondi e conservali a quattro gradi Celsius. Al microscopio, gli spermatidi rotondi di topo avevano un diametro di circa 10 micrometri e mostravano una struttura nucleolica simile a una sporgenza nel mezzo.
Per iniziare, procurati ovociti e spermatidi rotondi dai topi. Quindi, preparare gli aghi di tenuta e di iniezione con diametri appropriati. Mettere gli ovociti in goccioline M2 da 10 microlitri con o senza citocalasi B per ammorbidire e conservare i gameti.
Quindi, posizionare le goccioline rotonde M2 degli spermatidi e montare il piatto operatorio sul microscopico tavolo operatorio. Regolare la posizione dell'iniezione e fissare l'ago. Utilizzando il polivinilpirrolidone, o PVP, inumidire e pulire l'ago per iniezione.
Quindi, estrarre lo spermatide rotondo nell'ago per iniezione. Ruotare l'ovocita con l'ago di tenuta per orientare il corpo polare degli ovociti a ore 12. Quindi, posizionare con cautela l'ago per iniezione a ore tre sull'ovocita.
Utilizzando un dispositivo PiezoXpert, creare un foro nella zona pellucida degli ovociti. Quindi, far avanzare delicatamente l'ago per iniezione nell'ovocita orizzontalmente e rompere la membrana dell'ovocita. Iniettare gradualmente lo spermatide rotondo nel citoplasma dell'ovocita.
Estrarre l'ago per iniezione e aspirare una piccola quantità della membrana degli ovociti vicino all'apertura per sigillarla. Per l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, posizionare gli spermatozoi su una pista PVP. Aspirare gli spermatozoi dalla coda e posizionare il collo all'imboccatura dell'ago per iniezione.
Applicare un piezo per separare la testa dello spermatozoo dalla coda. Quindi, iniettare lo spermatozoo nell'ovocita come dimostrato in precedenza, con un ago per iniezione di 9-10 micrometri di diametro. Per l'attivazione assistita degli ovociti, posizionare gli ovociti in 20 microlitri di goccioline di terreno CZB privo di calcio e magnesio contenente cloruro di stronzio esaidrato.
Quindi, trasferiscili nel terreno di coltura KSOMaa per la coltivazione. Contemporaneamente, stabilire un gruppo per l'attivazione della partenogenesi senza iniettare spermatidi rotondi o spermatozoi per studi embriologici. Dopo l'attivazione, trasferire al terreno di coltura KSOMaa per la coltivazione.
Gli embrioni rotondi iniettati con spermatidi hanno mostrato una ridotta efficienza dello sviluppo rispetto a quelli iniettati con spermatozoi intracitoplasmatici.
