Name: a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. e da una borsa di sovvenzione di formazione dal National Cancer Institute (NIH) (CA009110) di S.R.W. e J.H.

L'uso di topi è stato approvato dal istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato della Johns Hopkins University. Gli esperimenti sono stati eseguiti su giovanile (20-26 giorni post-partum, dpp) topi C57BL/6J, approfittando della prima ondata semi-sincrona della spermatogenesi. Tuttavia, questa tecnica può essere eseguita anche utilizzando topi adulti.
1. dissezione e isolamento dei tubuli seminiferi del mouse
<ol><li>Preparare la correzione/soluzione e anticorpo diluizione buffer di lisi (ADB) descritto nella tabella 1 e tabella 2.</li>
	<li>Preparare una capsula di Petri 35 mm con 3 mL di 1x tampone fosfato salino (1x PBS, pH 7.4) e un altro piatto di 35mm con 2 mL di soluzione di correzione/Lisi per topo.</li>
	<li>Sacrificare il mouse tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia e spruzzare l'addome ventrale con etanolo al 70%. Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, rendendo un'apertura a forma di V. Quindi rimuovere i testicoli, tirando il grasso epididimario usando il forcipe ed evitare di disturbare la tunica albuginea. Posizionare i testicoli in una capsula Petri 35 mm contenente 1X PBS. Nota: Utilizzare la prima ondata di spermatogenesi al fine di osservare una popolazione delle cellule arricchite di interesse14. Fasi specifiche della spermatogenesi sono arricchite alle età del mouse differenti (tabella 3).</li>
	<li>Rimuovere il testicolo albuginea di Tunica perforando il tessuto con una pinza punta tagliente e raccogliere i tubuli seminiferi sciolti. Trasferire i tubuli una nuova 35 mm piastra Petri contenente 2 mL di soluzione di correzione/lisi.</li>
	<li>Incubare i tubuli nella soluzione fix/Lisi per 5 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparazione del tubulo seminifero
<ol><li>Preparare un vetrino di vetro rivestito di poli-L-lisina delineando i bordi della diapositiva con una penna di liquido bloccante.</li>
	<li>Applicare 100 µ l di soluzione di correzione/Lisi al centro del vetrino.</li>
	<li>Utilizzando pinze sterili e forbici delicatamente a pezzi stuzzicare i tubuli seminiferi. Taglio fuori tubulo lungo singolo segmenti di circa 20 mm di lunghezza. Nota: Per visualizzare le strutture che sono sensibili all'esposizione prolungata fissativo, quali i centrosomi, separare i tubuli prima in PBS 1X, quindi tritare direttamente i tubuli sulla superficie delle diapositive di poli-lisina rivestito in 100 µ l di soluzione di correzione-lisi.</li>
	<li>Trasferimento cinque segmenti di tubulo seminifero lungo 20 mm per il vetro rivestito di poli-L-lisina preparato diapositiva contenente soluzione di correzione/lisi.</li>
	<li>Utilizzando forbici sterili triti tubuli seminiferi in segmenti di 1,5 a 3,0 mm.</li>
	<li>Utilizzando pinze sterili disporre i segmenti tubulo il vetrino in modo che nessun tessuto si sovrappone, e i tubuli sono distribuiti in modo uniforme. Nota: Il numero di segmenti tubulo su un vetrino ottimale è tra 20 e 40.</li>
</ol>3. lo schiacciamento dei tubuli seminiferi
<ol><li>Trasferire il vetrino contenente segmenti Tubulo seminifero dispersi su un benchtop. Rimuovere il liquido in eccesso usando un laboratorio per evitare di perdere tessuto durante il passaggio di squash.</li>
	<li>Applicare un vetrino coprioggetti (22 x 60-1.5 mm) sopra il vetrino ed esercitare una pressione con il tallone del palmo della mano per 10-20 secondi. È importante applicare forza sufficiente a disperdere spermatociti da tubuli seminiferi. Nota: Osservare i tubuli utilizzando un microscopio di dissezione al fine di ottimizzare il passaggio schiacciamento, in modo che tutti i segmenti del tubulo sono interrotti.</li>
	<li>Usando il forcipe di diapositiva, immediatamente flash congelare il vetrino in un dewar piccolo liquido N2 per 15 secondi, o fino a quando il liquido non cessa di bolla. Se immunolabeling immediatamente, rimuovere il vetrino coprioggetto con una lama di rasoio bordo dritto, bene punta forcipe o ago da 21 gauge. Nota: Per ottenere risultati ottimali, marcatura le diapositive immediatamente (Vedi punto 4). Tuttavia, a questo punto diapositive possono essere conservati a-80 ° C fino a due settimane. Per ottimizzare la durata delle proteine e strutture cellulari, immediatamente archiviare le diapositive sul ghiaccio secco o trasferimento in un congelatore a-80 ° C e mantenere il coprioggetto sul vetrino. Quando immunolabeling memorizzati diapositive, è necessario rimuovere il vetrino coprioggetto immergendo i vetrini in liquido N2 per 15 secondi, come descritto al punto 3.3.</li>
</ol>4. Immunolabeling di tubuli seminiferi montati
<ol><li>Immergere il vetrino in 1X PBS e lavare tre volte per 5 min in una vaschetta di Coplin da 50 mL contenente 1X PBS. Nota: Mai lasciare i vetrini a completamente asciutto durante immunolabeling.</li>
	<li>Applicare 1 mL di tampone di diluizione di anticorpo su lastra di vetro viene bloccato per 1-2 h in una camera umidificata.</li>
	<li>Rimuovere il tampone di diluizione dell'anticorpo e applicare 100 µ l di anticorpo primario diluito in tampone di diluizione dell'anticorpo in una camera umidificata. Nota: Per risultati ottimali, Incubare gli anticorpi primari durante la notte a 4 ° C. Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es. 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm. Convalidare e ottimizzare gli anticorpi primari15.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini tre volte per 5 min in una vaschetta di Coplin 50 mL contenente 1X PBS. Nota: Per migliorare i lavaggi, agitare Coplin vasetti utilizzando una piccola ancoretta magnetica e posizionare su una piastra magnetica a bassa velocità o la vaschetta di Coplin su un mixer da tavolo a bassa velocità.</li>
	<li>Applicare 100 µ l di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione dell'anticorpo per 1-1,5 h in una camera umidificata a temperatura ambiente. Incubare i vetrini in una scatola scuro per evitare foto imbianchimento di anticorpi coniugato fluoroforo. Nota: Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es. 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini due volte per 5 min in una vaschetta di Coplin da 50 mL contenente 1X PBS.</li>
	<li>Montare i vetrini in mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e applicare i coprioggetti (22 x 60-1,5 mm).</li>
	<li>Sigillare i coprioggetti per le diapositive con smalto trasparente per preservare le diapositive e impediscono il movimento di lamelle.</li>
</ol>5. analisi e imaging del tubulo squash preparati
<ol><li>Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con fase automatizzata che consente il movimento dell'asse z preciso e una telecamera ad alta risoluzione per la cattura delle immagini. In alternativa, utilizzare un microscopio confocale laser. Nota: È possibile utilizzare qualsiasi software e hardware disponibile per questo passaggio. Ad esempio, immagini visualizzate in Figura 1 e Figura 2 sono state catturate utilizzando un Zeiss cella osservatore Z1 collegata a un'ORCA-Flash 4.0 CMOS telecamera e analizzati con il software di immagine di Zeiss ZEN 2012 blue edition.</li>
	<li>Valutare le diapositive utilizzando un obiettivo X 20 per determinare la qualità della preparazione squash. Diapositive di buona qualità hanno un monostrato di nuclei che sono distribuiti uniformemente. Nota: Alcune sezioni della diapositiva possono essere meglio di altri, è utile notare le coordinate di dove le migliori regioni della diapositiva possono essere trovate per ulteriori analisi con maggiore ingrandimento.</li>
	<li>Utilizzando il più alto obiettivo di ingrandimento (es. 63X o da 100x), cattura regioni della diapositiva che dispongono di un monostrato coerenza dei nuclei. Una volta selezionata una regione, impostare il superiore e inferiore Z-stack per garantire che tutta la luce messa a fuoco viene catturata. Nota: Il numero ottimo di Z-stack catturati tra il limite superiore e inferiore è generalmente indicato con il software di acquisizione di immagini e per ogni obiettivo è diverso.</li>
	<li>Utilizzare il software di elaborazione di immagini per compilare un'immagine messa a fuoco estesa profondità. Il software combina la luce messa a fuoco da ogni Z-stack ed è essenziale per l'acquisizione ottima delle preparazioni squash del tubulo.</li>
</ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis.">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li><li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique.">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF/TRF2+gene.">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li><li>Henriks&#233;n, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat:+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations.">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Topi hanno dimostrato di essere un organismo modello utile per studiare gli eventi cellulari che regolano la progressione meiotica durante la spermatogenesi. Inoltre, è necessario sviluppare strumenti adatta allo studio della spermatogenesi, perché molti eventi, come uscita dalla Profase Meiotica I, sono sessualmente dimorfica. Questo protocollo descrive un metodo di squash tubulo seminifero per la visualizzazione e lo studio delle diverse fasi della spermatogenesi del mouse. Questo metodo mantiene l'integrità cellula...

Meiosi sono un evento cellulare complesso in cui un singolo ciclo di replicazione del DNA è seguito da due successivi cicli di divisione cellulare. Diversi eventi di meiosi specifici devono essere coordinati durante le fasi iniziali della meiosi per assicurare la segregazione del cromosoma accurata. Questi eventi comprendono il completamento di ricombinazione omologa, co-orientamento della sorella cinetocori durante la prima divisione meiotica e la perdita graduale della coesina complessi per risolvere chiasmata tra omologhi. Regolazione precisa di questi processi è necessaria per mantenere la fertilità e cromosoma malsegregazione di eventi che possono portare a disturbi dello sviluppo genetici e aborto spontaneo1.
Mentre gli eventi chiavi della meiosi si svolgono sia maschi che femmine, esistono differenze significative di temporale e meccanicistiche tra spermatogenesi e oogenesi2. Ad esempio, durante la meiosi femminile, profase si verifica durante lo sviluppo embrionale e si arresta nella fase di dictyate fino alla pubertà. Al contrario, la spermatogenesi inizia alla pubertà e progredisce in onde tutta la vita adulta senza arresto. Le differenze tra maschio e femmina meiosi sottolinea la necessità di sviluppare metodi che sono specificamente orientate verso valutare questi processi sia spermatociti e ovociti. Attualmente, valutare la progressione meiotica in gran parte si basa sull'uso di cromatina spread3,4,5. Mentre gli spread della cromatina sono utili per studiare i cromosomi meiotici, riescono a preservare l'integrità cellulare, impedendo la valutazione delle strutture cellulari quali mandrino microtubuli, centrosomi, l'involucro nucleare e gli allegati del telomero. Live imaging e tecniche di coltura a lungo termine notevolmente hanno avanzato la nostra comprensione della meiosi femminile; approcci simili per visualizzare l'intera cellula intatta, tuttavia, sono meno frequentemente implementati per lo studio della spermatogenesi6,7. Per visualizzare gli eventi dinamici durante meiosi maschile, abbiamo adattato stabilito tubulo squash tecniche per valutare rapidamente le caratteristiche citologiche di sviluppare del mouse spermatociti8,9. Il metodo qui descritto mantiene l'integrità della cellula, permettendo lo studio di strutture cellulari multiple durante diverse fasi della spermatogenesi.
Questa tecnica di squash del tubulo è un approccio a cellula intera, che consente la valutazione delle strutture cellulari tramite microscopia di immunofluorescenza. Approcci comuni istologici di visualizzare progressione meiotica in di topo maschio come haematoxylin ed eosina di testicoli di paraffina ed etichettatura immunofluorescente di cryosections consentono un'ampia panoramica della progressione meiotica. Tuttavia, queste tecniche non riescono a risolvere le singole cellule nella misura necessaria per un'analisi dettagliata degli eventi che si verificano durante meiosi10,11. Tecniche alternative per visualizzare processi meiotici si basano su interruzioni significative chemiosmotica spermatocita per isolare e difficoltà materiali nucleari3,4,5. Questi trattamenti chimici ostacolano l'osservazione di tipi cellulari diversi da spermatociti primari. Un metodo recentemente descritto da Namekawa ha permesso alla comunità di ricerca di preservare l'architettura nucleare di spermatociti isolati, ma richiede l'uso di un cytospin e accessori che non siano prontamente disponibili per alcuni laboratori4. Al contrario, la tecnica di squash tubulo richiede solo attrezzature che è generalmente standard nella maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule.
Il metodo di squash tubulo qui descritto può essere utilizzato per visualizzare i tipi di cellule diversi trovati all'interno del tubulo seminifero, comprese cellule di sertoli, spermatogoni, spermatociti primari e secondari e spermatidi. Accoppiando questa tecnica con la prima ondata vicino-sincrono della spermatogenesi in topi giovani, è possibile ottenere arricchiti popolazioni delle cellule spermatogenetiche mentre progrediscono attraverso meiosi12. Questo processo permette l'analisi dettagliata dei processi durante la spermatogenesi, quali eventi precoci profase, il G2/MI e la metafase per transizioni anafase e spermiogenesi. Inoltre, preparazioni di squash tubulo possono essere utilizzati per visualizzare le caratteristiche citologiche dei cromosomi (ad es. interchromatid domini (ICD) e cinetocori) e centrosomi (centrioli e pericentriolar materiale/matrici). Il metodo di zucca può essere facilmente eseguito in parallelo con altri approcci sperimentali, come spread della cromatina ed estrazione di proteine. Inoltre, questa tecnica è stata modificata con successo per depositare le cellule spermatogenetiche viventi su slitte per la visualizzazione diretta13.
Il metodo qui descritto richiede una tecnica di squash del tubulo seminifero cellula intera per analizzare la transizione G2/MI in topi C57BL/6J wild-type. Le caratteristiche citologiche di spermatociti primari entrando la prima divisione meiotica sono state visualizzate con microscopia di immunofluorescenza per osservare il fuso meiotico. Questa tecnica versatile può essere facilmente modificata per visualizzare altre fasi meiotic e diversi tipi di cellule. La tecnica è anche favorevole alla strategie di visualizzazione alternativi, come DNA e RNA pesce approcci.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microsopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition image software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Mouse anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;gamma;H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>Courtesy of&amp;nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 in 1000</td></tr></tbody></table>

a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model

Progressione meiotica nei maschi è un processo che richiede l'azione concertata di un numero di eventi cellulari altamente regolamentati. Errori che si verificano durante la meiosi possono portare alla sterilità, perdita di gravidanza o difetti genetici. Che inizia all'inizio della pubertà e proseguendo per tutta l'età adulta, onde continue semi-sincrone di spermatociti subiscono la spermatogenesi e alla fine formano spermatozoi aploidi. La prima ondata di spermatociti di mouse in fase di iniziazione meiotica appaiono al 10 ° giorno post-parto (dpp 10) e vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero come sperma maturo a 35 dpp. Pertanto, è preferibile utilizzare topi all'interno di questo intervallo di tempo dello sviluppo al fine di ottenere popolazioni altamente arricchiti di interesse. Analisi delle fasi di rara delle cellule è più difficile in più vecchi topi grazie al contributo di successive ondate di spermatogenesi, che aumentano la diversità delle popolazioni cellulari all'interno dei tubuli. Il metodo qui descritto è una tecnica facile da implementare per la valutazione citologica delle cellule trovate all'interno dei tubuli seminiferi dei topi, tra cui spermatogoni, spermatociti e spermatidi. La tecnica di squash tubulo mantiene l'integrità delle cellule germinali maschili isolate e permette l'esame delle strutture cellulari che non sono facilmente visibili con altre tecniche. Per illustrare le possibili applicazioni di questa tecnica di squash tubulo, gruppo fusello è stato monitorato in spermatociti progredendo attraverso la profase alla metafase di transizione (transizione G2/MI). Inoltre, duplicazione centrosoma, inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) e formazione di mazzo del cromosoma sono stati valutati come esempi delle strutture citologiche che possono essere osservate utilizzando questo metodo di squash del tubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per individuare difetti specifici durante la spermatogenesi che sono causati dalla mutazione o perturbazione esogeni, e quindi, contribuisce alla nostra comprensione dei meccanismi molecolari della spermatogenesi.

Qui, abbiamo usato il metodo di squash tubulo visualizzare popolazioni di transitorio delle cellule che subiscono la profase alla metafase (G2/mi) transizione, che sono stati arricchiti dalla raccolta testicoli da topi wild-type giovanili che subiscono la prima ondata della spermatogenesi (24 DPP). Figura 1 raffigura immagini rappresentative delle varie fasi delle cellule che possono essere visualizzate utilizzando il metodo di squash del tubulo. Arricchita d...

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A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K Views.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura di iniezione di spermatidi rotondi murini per studiare lo sviluppo embrionale

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Iniezione di spermatide rotondo di topo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biologia

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

L'analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di