El método se basa en un software de código abierto para evaluar sistemáticamente las actividades motoras locales para el comportamiento de seguimiento de las moscas adultas y larvas de video grabado. Este método requiere una integración de dispositivos de bajo costo para registrar y analizar el comportamiento, lo que lo convierte en un enfoque asequible y efectivo para detectar la locomoción de la mosca. Esta tecnología se emplea para identificar la modificación del comportamiento en un modelo de mosca de enfermedad humana con deterioro del movimiento local, pero no es adecuada para tratar enfermedades, discapacidades o dificultades.
Es esencial borrar la ventana de video relevante durante el proceso de análisis, es decir, la ventana de video original y la de procesamiento. Para comenzar, mezcle el reactivo A y el reactivo B del kit de sílice en una proporción de uno a 10, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para preparar la arena de campo abierto para el seguimiento de locomoción de drosophila. A continuación, coloque la cámara HD en un trípode, ajustándola para que la lente de la cámara sea perpendicular a la superficie de la arena de sílice.
Luego abra el video con Fiji. Arrastre la barra de progreso al fotograma inicial y apruebe tácitamente. Elija todo el cuerpo de la mosca utilizando la herramienta de selección a mano alzada.
Haga clic en la imagen, ajuste y brillo y contraste para ajustar el balance de blancos hasta que el valor de gris del área seleccionada se acerque al fondo amplio. Transfiera la mosca anestesiada a la arena de campo abierto. Una vez que la mosca se recupere de la anestesia, coloque el plato de arena con la mosca debajo de la cámara y agítelo rápidamente de lado a lado para asegurarse de que la mosca esté en movimiento cuando comience la grabación.
Presione el botón de grabación en la aplicación de la cámara para iniciar la grabación de video. Al finalizar la grabación, presione el botón de parada para finalizar la grabación de video. Convierta los videos grabados en formato AVI con codificación pagana M-J para que puedan abrirse y analizarse usando Fiji.
También establezca los fotogramas por segundo del video a 15 fps para moscas adultas y 12 fps para larvas. Para abrir el video con Fiji, seleccione las dos opciones, use la pila virtual y conviértala a escala de grises, en la ventana emergente. Obtenga una ventana de procesamiento utilizando la herramienta de configuración de imagen activa del complemento de seguimiento de animales y cree un área de seguimiento que rodee la arena en la ventana de video original, utilizando la herramienta ovalada.
Defina los filtros y los parámetros de los dos filtros para el primer fotograma en blanco de la ventana de procesamiento. A continuación, seleccione el siguiente fotograma en la ventana de vídeo original y elija la superficie filtrada de la ventana de procesamiento. Una vez seleccionada una ventana de procesamiento filtrada, utilice la herramienta Establecer umbral para girar el tracto con un perfil rojo, cubierto en la ventana de procesamiento.
A continuación, utilice el detector de blobs establecido para permitir que el equipo reconozca la mosca con un perfil rojo, cubierto en la ventana de procesamiento. Establezca el último fotograma para la mosca adulta o las larvas, como se describe en el texto manuscrito. Use la herramienta Mostrar blobs para presentar un rectángulo de seguimiento en la ventana de vídeo original.
Inicie el seguimiento y exporte el archivo de seguimiento una vez completada la supervisión. Cargue los archivos de seguimiento y zona utilizando el complemento de rastreador de animales y analizador de seguimiento. Seleccione el índice deseado mediante la configuración de zona y modifique la configuración de parámetros.
Calcule el tiempo del intervalo de fotogramas utilizando la velocidad de fotogramas. Produzca los gráficos de análisis cuantitativo utilizando el software de hoja de cálculo y el prisma del panel gráfico, después de ser analizados en el analizador de seguimiento. Abra el archivo de pista.
Copie todas las coordenadas en Microsoft Office Excel y divida las celdas con la tecla espaciadora. Para calcular el tiempo de inmovilidad por intervalo de fotogramas, seleccione todos los resultados calculados e inserte un gráfico de columnas para mostrar visualmente el tiempo de inmovilidad por el margen de todo el gráfico de columnas. Para ilustrar los cambios en el ángulo de dirección, seleccione todos los resultados calculados e inserte un diagrama de dispersión.
Las moscas adultas y las larvas del tercer estadio, tratadas con rotenona, tuvieron déficits locomotores significativos en comparación con las moscas de control, alimentadas con DMSO solvente. El análisis cuantitativo del tratamiento con rotenona en moscas adultas mostró una disminución significativa en la distancia recorrida y la velocidad media. Y un aumento significativo en el tiempo de inmovilidad.
Los gráficos representativos mostraron menos picos para la velocidad de movimiento por intervalo de cuadro en moscas alimentadas con rotenona en comparación con las del control, lo que indica la gravedad del déficit de actividad locomotora. La columna de inmovilidad institucional de píxeles movidos por fotograma también mostró significativamente menos movimiento en un minuto para las moscas alimentadas con rotenona, en comparación con las moscas de control. Los gráficos representativos que ilustran el ángulo móvil de los cambios de dirección en los animales alimentados con rotenona y control también revelaron alteraciones en la dirección elegida por las moscas.
Se observaron resultados similares para las larvas del tercer estadio. Los resultados revelaron que el movimiento conductual del seguimiento de larvas alimentadas con rotenona se vio significativamente afectado en comparación con el control. El paso más crucial en el proceso de análisis es formar el primero de marco en blanco, ya que evidencia si el software puede verificar de manera efectiva.
Esta tecnología podría permitir a los investigadores profundizar en el mecanismo subyacente de múltiples defectos, como lesiones nerviosas o musculares.
