Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sull'attività di trasposone

Questo protocollo ci consente di quantificare le statistiche di escissione su base singola cellula, invece di guardare al comportamento di massa. A questo livello, possiamo monitorare il comportamento delle singole cellule nel tempo, compresi i loro livelli di TnpA e TnpB per le cellule che si asportano rispetto alle cellule che non lo fanno, il che può permetterci, ad esempio, di misurare gli effetti degli eventi mutazionali identificati sul tasso di crescita. Questo metodo è un modo semplice e a basso costo per misurare le dinamiche mutazionali delle cellule vive.

L'approccio generale è applicabile a qualsiasi sistema che richieda l'imaging fluorescente a cellule vive. Preparare un vetrino facendo bollire M63 con 0,5% di glucosio e 1,5% di agarosio nel microonde per sciogliere l'agarosio. Assicurarsi che il mezzo sia completamente fuso e ben miscelato.

Lasciare raffreddare la miscela a 55 gradi Celsius prima di aggiungere antibiotici e induttori. Posizionare un vetrino da microscopio sul banco di lavoro. Impilare una diapositiva perpendicolare alla prima.

Assicurarsi che vi sia uno spazio pari allo spessore di una diapositiva tra la diapositiva inferiore e superiore. Pipettare un millilitro della miscela di agarosio M63 nello spazio tra il vetrino lentamente per creare un piccolo quadrato di gel. Una volta che il gel si è solidificato, far scorrere il vetrino superiore per rimuoverlo.

Tagliare il tampone di agarosio con una lama di rasoio o un coltello. Quindi, pipettare 2,5 microlitri della coltura batterica e mettere il coperchio sopra. Sigillare lo spazio tra la slitta e la sottoveste di copertura con resina epossidica.

Lasciare asciugare la resina epossidica e depositare le cellule sul tampone di agarosio per un'ora a 37 gradi Celsius. Posizionare il campione preparato su un microscopio a fluorescenza in un ambiente riscaldato e mantenuto a 37 gradi Celsius. Per ogni lunghezza d'onda, trova il campo visivo contenente fluorescenza minima.

Impostare un protocollo per acquisire immagini in una griglia a diverse lunghezze d'onda e a intervalli di tempo regolari. Gli eventi di escissione dei trasposoni determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3, consentendo l'identificazione di cellule sottoposte ad attività trasposonale mediante fluorescenza blu brillante. TnpB aumenta il tasso di escissione del trasposone.

Le cellule che esprimono la proteina accessoria TnpB sperimentano livelli da quattro a cinque volte più elevati di attività trasposonale rispetto alle cellule TnpB-negative. Nelle cellule TnpB-positive, le cellule sottoposte a eventi di escissione trasposonica hanno livelli di espressione più elevati di mCherry TnpB rispetto alla popolazione generale. Inoltre, per le cellule sottoposte a eventi di escissione, le cellule TnpB-positive esprimono solo livelli marginalmente più elevati di TnpA-trasposasi venosa rispetto alle cellule TnpB-negative, che è superiore alla fluorescenza gialla della popolazione generale.

Il posto più probabile per lottare è nella preparazione della coltura cellulare per l'esperimento. È necessario assicurarsi che le cellule siano cresciute fino alla fase esponenziale e che il vetrino sia inoculato con un numero appropriato di cellule. Ricordarsi di fare attenzione alle bolle quando si sigilla il vetrino in modo che il gel di agarosio non si asciughi.