القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon

يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد إحصائيات الاستئصال على أساس خلية واحدة ، بدلا من النظر إلى السلوك بالجملة. في هذا المستوى ، يمكننا تتبع سلوك الخلايا الفردية بمرور الوقت ، بما في ذلك مستويات TnpA و TnpB للخلايا التي تستأصل مقابل الخلايا التي لا تفعل ذلك ، والتي يمكن أن تسمح لنا ، على سبيل المثال ، بقياس آثار الأحداث الطفرية المحددة على معدل النمو. هذه الطريقة هي طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لقياس ديناميكيات طفرات الخلايا الحية.

النهج العام قابل للتطبيق على أي نظام يتطلب التصوير الفلوري للخلايا الحية. تحضير شريحة عن طريق غلي M63 مع 0.5 ٪ الجلوكوز و 1.5 ٪ agarose في الميكروويف لإذابة agarose. تأكد من ذوبان الوسط تماما وخلطه جيدا.

اترك الخليط يبرد إلى 55 درجة مئوية قبل إضافة المضادات الحيوية والمحرضات. ضع شريحة مجهر على طاولة العمل. قم بتكديس شريحة واحدة بشكل عمودي على الأولى.

تأكد من وجود فجوة تساوي سمك شريحة واحدة بين الشريحة السفلية والعلوية. ماصة ملليلتر واحد من خليط الأغاروز M63 في الفجوة بين الشريحة ببطء لإنشاء مربع هلام صغير. بمجرد أن يتجمد الجل ، حرك الشريحة العلوية لإزالته.

تقليم وسادة agarose بشفرة حلاقة أو سكين. ثم ، ماصة 2.5 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية ووضع غطاء زلة على القمة. أغلق المسافة بين الشريحة وانزلاق الغطاء باستخدام الإيبوكسي.

اترك الإيبوكسي يجف وتستقر الخلايا على وسادة الأغاروز لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع العينة المحضرة على مجهر مضان في بيئة يتم تسخينها وصيانتها عند 37 درجة مئوية. لكل طول موجي ، ابحث عن مجال الرؤية الذي يحتوي على الحد الأدنى من التألق.

قم بإعداد بروتوكول للحصول على الصور في شبكة بأطوال موجية مختلفة وعلى فترات زمنية منتظمة. تؤدي أحداث استئصال Transposon إلى إعادة تكوين المروج ل mCerulean3 ، مما يسمح بتحديد الخلايا التي تخضع لنشاط Transposon عن طريق التألق الأزرق الساطع. TnpB يعزز معدل استئصال الترانسبوزون.

تشهد الخلايا التي تعبر عن البروتين التبعي TnpB مستويات أعلى بأربع إلى خمس مرات من نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا السلبية TnpB. في الخلايا الإيجابية TnpB ، تحتوي الخلايا التي تخضع لأحداث استئصال الترانسبوزون على مستويات تعبير أعلى من mCherry TnpB من عامة السكان. علاوة على ذلك ، بالنسبة للخلايا التي تخضع لأحداث الاستئصال ، تعبر الخلايا الإيجابية TnpB عن مستويات أعلى بشكل هامشي فقط من TnpA-transposase الوريدي من الخلايا السلبية TnpB ، وهي أعلى من التألق الأصفر لعامة السكان.

المكان الأكثر احتمالا للنضال هو إعداد ثقافة الخلية للتجربة. يجب عليك التأكد من نمو الخلايا إلى الطور الأسي وأن الشريحة ملقحة بعدد مناسب من الخلايا. تذكر أن تنتبه للفقاعات عند إغلاق الشريحة حتى لا يجف جل الأغاروز.