Questo è un protocollo semplice ed efficace in termini di tempo per isolare e concentrare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali. Questa tecnica è facile da adottare nella maggior parte dei laboratori in quanto è una bilancia da banco e richiede solo strumenti semplici per le operazioni. Per isolare una delle piccole vescicole extracellulari, raccomandiamo di far crescere le cellule su larga scala per ottenere un minimo di centinaia di milioni di cellule.
Anche se sembra semplice, alcuni passaggi critici di questa tecnica sono meglio informati attraverso la dimostrazione visiva. Speriamo che i ricercatori possano imparare dalla nostra esperienza e padroneggiare le competenze con sicurezza. Il nostro dottorando, Mr.Chan, Hong Hao, ti guiderà attraverso la nostra esperienza nell'isolamento e nella caratterizzazione di piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali.
Per iniziare, centrifugare il mezzo condizionato a 200 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micrometri per rimuovere particelle più grandi di 220 nanometri. Riempito un gruppo filtrante centrifugo con 30 millilitri di soluzione salina filtrata con tampone fosfato filtrato da 0,2 micrometri.
Quindi centrifugare l'unità filtrante centrifuga a 3.500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Aggiungere 70 millilitri di mezzo filtrato condizionato nell'unità filtrante centrifuga e centrifugare l'unità a 3.500 g a quattro gradi Celsius.
Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Aggiungere 30 millilitri di soluzione salina filtrata tamponata con fosfato e centrifugare l'unità a 3.500 g a quattro gradi Celsius. Installare un bicchiere di raccolta del concentrato sull'unità filtrante e centrifugare inversamente a 1.000 g per due minuti a quattro gradi Celsius per ottenere le piccole vescicole extracellulari purificate.
Filtrare le piccole vescicole extracellulari attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri. Trasferire i campioni in nuove provette e conservarli a 80 gradi Celsius per ulteriori analisi. Per iniziare l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, diluire le piccole vescicole extracellulari isolate delle cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale umano in soluzione salina filtrata tamponata con fosfato a 20-100 particelle per fotogramma.
Introdurre un millilitro del campione diluito nella camera anti-A utilizzando siringhe monouso da un millilitro. Impostare le impostazioni di misurazione di conseguenza. Regolare il livello della videocamera al livello 14.
Per ogni misurazione, fare clic sulla misurazione standard e impostare la diluizione di conseguenza. Quindi, fai clic su Acquisisci, Avvia fotocamera e imposta il livello della fotocamera su 14 per visualizzare i piccoli veicoli elettrici. Per avviare la misurazione, fare clic su Crea, quindi su Esegui script e selezionare la posizione in cui salvare i file.
Digitare i dettagli necessari dell'esempio e fare clic su OK. Fare clic sull'impostazione OK per continuare lo script e fare clic su OK per avviare la misurazione. Una volta registrata la misurazione, analizza i risultati con una soglia di rilevamento di cinque per includere da 10 a 100 croci rosse per fotogramma. E il conteggio delle croci blu è limitato a cinque.
Fare clic su Impostazione OK per continuare lo script e avviare l'analisi. Fare clic su OK nella notifica di completamento dello script ed esportare per esportare i dati nella posizione impostata. Lisare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano con tampone di lisi per il saggio di radioimmunoprecipitazione ghiacciata e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Raccogliere il surnatante dopo aver centrifugato a 200g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quantificare la proteina utilizzando un test BCA. Assemblare il set di elettroforesi su gel di conseguenza ed eseguire l'elettroforesi su gel a 90 volt fino a quando la proteina raggiunge l'estremità del gel impilabile.
Cambiare la tensione a 200 volt per separare le proteine fino alla fine del gel risolutivo. Eseguire il trasferimento semi-secco per trasferire le proteine dal gel a una membrana di difluoruro di polivinilidene a 15 volt per un'ora. Bloccare la membrana PVDF con albumina sierica bovina al 3% in soluzione salina tamponata tris 0,1%Tween 20 per un'ora su uno shaker a temperatura ambiente.
Incubare la membrana PVDF con anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione costante. Il giorno successivo, lavare la membrana PVDF cinque volte e cinque minuti ciascuno con TBST e incubare ulteriormente con un anticorpo secondario per un'ora con agitazione a temperatura ambiente. Anche in questo caso, lavare la membrana PVDF con TBST cinque volte e visualizzare la membrana in un imager ad accoppiamento di carica utilizzando un reagente di rilevamento chemiluminescente.
Analizzare il livello di espressione delle proteine utilizzando il software ImageJ. Innanzitutto, apri il file di immagine in ImageJ. Migliora la qualità dell'immagine regolando la luminosità e il contrasto.
Regolare l'immagine fino a quando le macchie sono chiaramente visibili. Fare clic sul pulsante Applica e salvare le immagini in formato TIFF. Per l'analisi basata sul microscopio elettronico a trasmissione, diluire una parte del campione di piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano con quattro parti di soluzione salina filtrata tamponata con fosfato per un volume totale di 10 microlitri e incubare su una griglia di rame rivestita di carbonio per 15 minuti.
Rimuovere il campione in eccesso con una salvietta da laboratorio e lasciarlo asciugare all'aria per tre minuti. Incubare 10 microlitri di soluzione di acido fosfotungstico all'1% per macchiare il campione per tre minuti. Rimuovere la soluzione di acido fosfotungstico all'1% in eccesso utilizzando una salvietta da laboratorio e lasciarla asciugare all'aria per tre minuti per l'immagine al microscopio elettronico a trasmissione.
Le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano hanno una modalità granulometrica di 53 nanometri, mentre altri picchi significativi di dimensione delle particelle erano 96 e 115 nanometri. La concentrazione di piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano misurata da NTA era 7,75 volte da 10 a 10 particelle per millilitro. La concentrazione proteica delle piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano misurata con il test BCA era di circa 80 microgrammi per millilitro.
Nell'analisi western blotting, le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano hanno dimostrato bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101, ma erano negative per GRP94. Le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano isolate sono state visualizzate sotto TEM per determinarne le dimensioni e la morfologia. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale umano piccole vescicole extracellulari hanno dimensioni di circa 100 nanometri e hanno mostrato una struttura a membrana a doppio strato simile a una coppa.
Con il successo dello sviluppo del protocollo, possiamo ora scoprire le potenzialità terapeutiche delle cellule staminali mesenchimali derivate da piccole vescicole extracellulari nelle medicine rigenerative.
