Este é um protocolo simples e eficaz em termos de tempo para isolar e concentrar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais. Esta técnica é fácil de ser adotada na maioria dos laboratórios, pois é uma balança de bancada e requer apenas instrumentos simples para operações. Para isolar uma das pequenas vesículas extracelulares, recomendamos o crescimento de células em larga escala para obter um mínimo de cem milhões de células.
Embora pareça simples, alguns passos críticos dessa técnica são melhor informados por meio da demonstração visual. Esperamos que os pesquisadores possam aprender com nossa experiência e dominar as habilidades com confiança. Nosso aluno de doutorado, Sr.Chan, Hong Hao, irá guiá-lo através de nossa experiência em isolamento e caracterizações de pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais.
Para começar, centrifugar o meio condicionado a 200g por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares. Coletar e filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 micrômetro para remover partículas maiores que 220 nanômetros. Encheu uma unidade de filtro centrífugo com 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato filtrado de 0,2 micrômetro.
Em seguida, centrifugar a unidade de filtro centrífugo a 3.500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Adicione 70 mililitros de meio condicionado filtrado na unidade de filtro centrífugo e centrifugue a unidade a 3.500g a quatro graus Celsius.
Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Adicione 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato filtrado e centrifugar a unidade a 3.500g a quatro graus Celsius. Instale um copo coletor de concentrado na unidade filtrante e centrífuga reversa a 1.000g por dois minutos a quatro graus Celsius para obter as pequenas vesículas extracelulares purificadas.
Filtrar as pequenas vesículas extracelulares através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Transfira as amostras para novos tubos e armazene-as a 80 graus Celsius para análise posterior. Para iniciar a análise de rastreamento de nanopartículas, dilua as células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano isoladas de pequenas vesículas extracelulares em solução salina tamponada com fosfato filtrado para 20 a 100 partículas por quadro.
Introduzir um mililitro da amostra diluída na câmara anti-A utilizando seringas descartáveis de um mililitro. Defina as configurações de medição de acordo. Ajuste o nível da câmera para o nível 14.
Para cada medição, clique na medida padrão e defina a diluição de acordo. Em seguida, clique em Capturar, Iniciar câmera e defina o Nível da câmera como 14 para visualizar os pequenos EVs. Para iniciar a medição, clique em Criar, em Executar Script e selecione o local onde os arquivos precisam ser salvos.
Digite os detalhes necessários do exemplo e clique em OK. Clique na configuração OK para continuar o script e clique em OK para iniciar a medição. Uma vez que a medição tenha sido registrada, analise os resultados com um limiar de detecção de cinco para incluir 10 a 100 cruzes vermelhas por quadro. E a contagem de cruzes azuis é limitada a cinco.
Clique em Configuração OK para continuar o script e iniciar a análise. Clique em OK na notificação de conclusão do script e exporte para exportar os dados para o local definido. Lisar as células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano, pequenas vesículas extracelulares com tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação gelada e incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Recolher o sobrenadante após centrifugar a 200g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Quantificar a proteína usando um ensaio de BCA. Monte a eletroforese em gel ajustada de acordo e realize a eletroforese em gel a 90 volts até que a proteína atinja o final do gel de empilhamento.
Mude a tensão para 200 volts para separar as proteínas até o final do gel de resolução. Realizar transferência semi-seca para transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno a 15 volts por uma hora. Bloquear a membrana de PVDF com albumina de soro bovino a 3% em solução salina tamponada a 0,1% Tween 20 por uma hora em agitador à temperatura ambiente.
Incubar a membrana de PVDF com anticorpos primários a quatro graus Celsius durante a noite com agitação constante. No dia seguinte, lavar a membrana de PVDF cinco vezes e cinco minutos cada com TBST e incubar com um anticorpo secundário por uma hora com agitação à temperatura ambiente. Novamente, lave a membrana de PVDF com TBST cinco vezes e visualize a membrana em um imageador acoplado à carga usando um reagente de detecção quimioluminescente.
Analise o nível de expressão das proteínas utilizando o software ImageJ. Primeiro, abra o arquivo de imagem no ImageJ. Melhore a qualidade da imagem ajustando o brilho e o contraste.
Ajuste a imagem até que as manchas fiquem claramente visíveis. Clique no botão Aplicar e salve as imagens no formato TIFF. Para análise baseada em microscópio eletrônico de transmissão, diluir uma parte da amostra de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano de pequenas vesículas extracelulares com quatro partes de solução salina tamponada com fosfato filtrado para um volume total de 10 microlitros e incubar em uma grade de cobre revestida de carbono por 15 minutos.
Retire o excesso de amostra usando um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por três minutos. Incubar 10 microlitros de solução de ácido fosfotúngstico a 1% para manchar a amostra durante três minutos. Remova o excesso de solução de ácido fosfotúngstico a 1% usando um lenço de laboratório e deixe-o secar ao ar por três minutos para obter imagens em um microscópio eletrônico de transmissão.
As células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano pequenas vesículas extracelulares têm um modo de tamanho de partícula de 53 nanômetros, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram de 96 e 115 nanômetros. A concentração de pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano medida por NTA foi de 7,75 vezes 10 a 10 partículas por mililitro. A concentração de proteínas de pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano, medida com o ensaio de BCA, foi de aproximadamente 80 microgramas por mililitro.
Na análise de western blotting, pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101, mas foram negativas para GRP94. As pequenas vesículas extracelulares derivadas do cordão umbilical humano foram visualizadas sob MET para determinar seu tamanho e morfologia. Células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano pequenas vesículas extracelulares de tamanho aproximado de 100 nanômetros e mostraram uma estrutura de membrana bicamada semelhante a uma taça.
Com o desenvolvimento bem-sucedido do protocolo, podemos agora descobrir os potenciais terapêuticos de células-tronco mesenquimais derivadas de pequenas vesículas extracelulares em medicamentos regenerativos.
