Riattivazione di modelli cellulari demembranati in Chlamydomonas reinhardtii

Questo metodo può aiutare a capire quali fattori influenzano la motilità delle ciglia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i fenomeni che si verificano solo temporaneamente in vivo, tale inversione delle concentrazioni di ioni calcio nelle ciglia possono essere continuamente osservate in vitro. Questo metodo contribuisce specificamente al campo di ricerca delle ciglia mobili.

Sarebbe difficile per i principianti eseguire la fase di demembranazione. Quindi, si consiglia vivamente di eseguire i passaggi in modo delicato ma preciso. Iniziare centrifugando circa 10 millilitri di coltura Chlamydomonas reinhardtii a 1.000 RCF a 20 gradi Celsius per tre minuti.

Decantare il surnatante e aspirare il resto con una pipetta Pasteur. Risospese i precipitati in circa cinque millilitri di tampone di lavaggio. Centrifugare le celle nel tampone di lavaggio a 1.000 RCF per tre minuti a 20 gradi Celsius.

Scartare il surnatante con attenzione con una pipetta. Aggiungere circa 0,5 millilitri di tampone di demembranazione al pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per sospendere approssimativamente le cellule nel tampone, quindi mettere il tubo sul ghiaccio.

Sospendere delicatamente il pellet cellulare rimanente con una pipetta e posizionare nuovamente il tubo sul ghiaccio. Prendi da 5 a 10 microlitri del modello cellulare, diluisci dieci volte con il tampone di diluizione e osserva al microscopio per confermare che tutti i modelli cellulari sono demembranati e non nuotano. In un tubo da 0,5 millilitri, mescolare 80 microlitri di soluzione di riattivazione, 10 microlitri di soluzione di ATP e 10 microlitri di modelli di celle toccando il tubo.

Mettere circa 30 microlitri della soluzione mista su una diapositiva di vetro e posizionare delicatamente un coperchio scivolare su di esso con distanziali per evitare uno shock meccanico al modello di cella. Osservare i modelli cellulari riattivati al microscopio. Dopo la demembranazione della coltura di C.reinhardtii, tutti i modelli cellulari sono diventati immotili e le ciglia demembranate sono rimaste attaccate al corpo cellulare, confermando che l'immotilità dei modelli cellulari non era causata dalla de-ciliazione.

Dopo aver mescolato i modelli cellulari con il tampone di riattivazione in ATP, oltre il 50% dei modelli cellulari è diventato mobile. Anche senza il sistema di rigenerazione dell'ATP, le cellule riattivate hanno continuato a muoversi per circa 90 minuti con una concentrazione finale di ATP di un millimolare prima di fermarsi gradualmente. La fase di demembranazione è fondamentale.

Tutte le cellule dovrebbero smettere di nuotare, ma non dovrebbero essere mescolate così fortemente da verificarsi la de-ciliazione. I ricercatori possono modificare questo protocollo per includere reagenti come ioni calcio o AMP ciclico, o eseguire esperimenti con un mutante privo di una particolare proteina per identificare il loro ruolo biologico.