Abbiamo sviluppato un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di drosophila in coltura. Questo metodo può fornire fattori esogeni ai terreni di coltura e può testare la riattivazione dei neuroblasti. Migliori terapie con cellule staminali potrebbero essere sviluppate da una migliore comprensione di come le cellule staminali quiescenti rispondono ai segnali estrinseci ed entrano nel ciclo cellulare.
A dimostrare la procedura sarà Susan Doyle, ricercatrice del mio laboratorio. Per iniziare con attenzione raccogliere circa 20-25 larve appena nate dalla piastra di agar d'uva sotto un microscopio di dissezione. Riempire una capsula di Petri con circa due millilitri di PBS e immergere la punta dello strumento contenente larve in PBS per due minuti.
Dopo due minuti, capovolgere il piatto ad angolo per raggruppare il liquido sul fondo e, usando un piccolo pennello, spazzolare le larve dal liquido sul fondo della capsula di Petri. Raccogliere tutte le larve sul pennello e risciacquare brevemente le larve con il 70% di etanolo prima di trasferirle nella capsula di Petri contenente PBS. Spruzzare l'area di lavoro, gli strumenti di dissezione, la pinza e due piatti in vetro con etanolo al 70% e lasciarli asciugare sul banco.
Prepara il terreno di coltura integrato di Schneider, o SSM, e mettilo sul ghiaccio. Pipettare un millilitro del mezzo in ogni piatto di vetro. Utilizzando una micropipetta con una punta sterile, trasferire le larve appena schiuse dalla piastra di PBS all'SSM nel primo piatto di vetro.
Seziona il cervello dalle larve poste nella seconda parabola di vetro con SSM usando una pinza sotto un microscopio di dissezione e regolando l'ingrandimento secondo necessità. Usa una pinza per afferrare i ganci della bocca e, con l'altra, afferra delicatamente il corpo a metà strada e tira nella direzione opposta per dividere la larva in due pezzi. Dopo aver sezionato da 15 a 20 cervelli, aggiungere un millilitro di SSM in un pozzo di un vassoio di coltura sterile a 24 pozzetti.
Usando una micropipetta e una punta sterile, trasferire i cervelli appena sezionati nell'SSM, seguiti dall'incubazione dei media con il cervello per 24 ore a 25 gradi Celsius. Pipettare 10 microlitri di uno stock di 10 millimolari di 5-etinil-2'deossiuridina, o EDU, con 990 microlitri di SSM in un tubo microcentrifuga sterile, mescolare, quindi pipettare un millilitro di EDU SSM in un pozzo del vassoio di coltura sterile a 12 pozzetti. Trasferire il cervello utilizzando una micropipetta con una punta sterile dal pozzo contenente SSM al nuovo pozzo contenente la soluzione EDU SSM e incubare per un'ora a 25 gradi Celsius.
Quindi, trasferire i cervelli etichettati EDU in un altro pozzo nello stesso vassoio di coltura contenente un millilitro di fissativo e consentire al cervello di essere fissato per 20 minuti. Dopo la fissazione, trasferire rapidamente il cervello in un minitray pozzetto a 72 pozzetti usando una micropipetta. Risciacquare il cervello tre volte in 10 microlitri di PBT e ripetere tre lavaggi per 10 minuti ciascuno, assicurandosi che i cervelli siano sempre coperti da del liquido.
Pipetta 10 microlitri di soluzione bloccante sul cervello. Coprire il vassoio e sigillarlo con una striscia di parafilm attorno al bordo. La figura mostra cellule neuroblasti EDU-positive e deadpan-positive di grandi dimensioni dopo 24 ore di coltivazione in SSM con insulina e colorazione.
Dopo 24 ore nel media integrato di Schneider senza insulina, i cervelli di tipo selvaggio dell'Oregon R appena nati non avevano cellule neuroblasti EDU-positive e deadpan-positive di grandi dimensioni, a parte le cellule neuroblasti a quattro funghi e una cellula neuroblastica ventrolaterale. Durante l'imaging confocale, alcuni emisferi cerebrali con danni, come fori di piccole e grandi dimensioni nel tessuto cerebrale espiantato, sono stati occasionalmente osservati. Eventuali cervelli con buchi non sono stati utilizzati per l'analisi.
Sezionare i tessuti con cura e pipettare delicatamente per evitare danni ai tessuti. Cerca anche di essere il più sterile possibile e non contaminare le tue culture. Poiché i terreni di coltura possono essere facilmente manipolati aggiungendo diversi fattori, questa tecnica può essere utilizzata per affrontare ipotesi future riguardanti la segnalazione estrinseca e l'ingresso e l'uscita della quiescenza dei neuroblasti.
