Name: assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

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The authors have nothing to disclose.

Profilatura polisomale è una tecnica potente che consente la quantificazione dello stato della traduzione di trascritti specifici in diverse condizioni di trattamento. Si tratta di una tecnica molto semplice principio che tuttavia richiede diverse fasi di esecuzione, alcune delle quali sono critici per la produzione di buoni profili polisoma. Questi passaggi chiave sono: 1) uso di prodotti chimici RNase-free e plasticware, 2) la preparazione di ottimi gradienti di saccarosio (nella nostra esperienza un 10-50% gradienti di saccarosio funzionano meglio per risolvere in modo efficiente 40 / 60S subunità e mRNA con ribosomi legato), e 3 ) utilizzando cellule che sono in crescita esponenziale e non confluenti oltre l&#39;80%, al fine di catturare i più alti tassi di traduzione. Quest&#39;ultimo passo dovrebbe essere presa in considerazione quando si fa trattamenti lunghi cellulari, come knockdown gene o sovraespressione, in modo che la quantità di cellule per piastra sarà una funzione di quanto le cellule saranno confluenti al punto finale. Nei risultati presented qui, polisoma analisi del profilo è stato uno strumento importante per valutare il ruolo PDCD4 nella regolazione traduzione dei IRES-mRNA ospitano XIAP e Bcl-xL 12. Il fatto che non abbiamo osservato alcun cambiamento nei profili generali polisoma su PDCD4 knock-down (Figura 1B) ci ha permesso di concludere che PDCD4 non ha compromesso traduzione globale cellulare nelle condizioni dell&#39;esperimento. Abbiamo poi utilizzato l&#39;analisi di RT-qPCR per determinare la distribuzione del XIAP e Bcl-xL mRNA in cellule trattate con PDCD4 o siRNA di controllo. qPCR è un metodo di scelta per analizzare profili polisoma, rispetto allo standard di RT-PCR o Northern blotting, perché permette di quantitativa piuttosto che un&#39;analisi semi-quantitativa della distribuzione mRNA e per la rilevazione di sottili variazioni nell&#39;efficienza traslazionale tra i trattamenti. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che la distribuzione delle XIAP e Bcl-xL mRNA (espresso come percentuale del target totale mRNA in tutto il gradient) era significativamente spostato in poliribosomi pesanti (mRNA con un gran numero di ribosomi ad essi associati) dopo PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando così un aumento di definizione di questi mRNA. Ciò è stato ulteriormente confermato da un aumento XIAP e Bcl-xL livelli di proteina, ma non nei loro livelli di RNA allo stato stazionario (Figura 1F, G). È importante sottolineare che la distribuzione polisoma della variante non-IRES di XIAP è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). In alternativa, l&#39;efficienza traduzionale potrebbe essere presentato come un rapporto di contenuto di mRNA in polisomi (solitamente frazioni 5 a 10) rispetto monosomes (solitamente frazioni 2 a 4) 14. L&#39;uso dei controlli in tutta il protocollo è importante nel convalidare qualsiasi polisoma risultato profiling, come picchi osservati dalle letture di assorbanza a 254 nm non possono da soli essere attribuito ad RNA ribosomiale (detergentes, come Triton X-100 fortemente assorbono in questa regione dello spettro e possono oscurare 40 / 60S picchi nella parte superiore del gradiente). Sfumature in bianco, senza lisato e / o con tampone lisato devono essere eseguiti per determinare il contributo relativo dei buffer per l&#39;assorbanza a 254 nm. Artefatti strutture di ordine superiore possono anche portare a interpretazioni errate di polisomi dove ci sono in effetti nessuno (ad esempio, &quot;pseudo-polisomi&quot; 20). Sequestranti magnesio (utilizzato durante tutta la procedura di stabilizzare ribosomi 80S) con l&#39;EDTA cationi bivalenti chelante aggiunti lisati e al buffer gradiente (20 mM per 15 min) provoca la separazione del ribosoma nei suoi componenti piccoli (40S) e grandi (60S ) subunità. Pertanto, se i picchi di assorbanza a 260 nm registrati sono infatti polisomi, trattamento EDTA collasserà il profilo tale osserverà una singola massima nella parte superiore del gradiente che corrisponde a liberare mRNA e unità ribosomiale (dati non mostrati). Coincidentecon EDTA indotta crollo del profilo, tutti gli obiettivi specifici analizzati da qPCR occorre ora trovato nella parte superiore del gradiente. Il numero dei ribosomi associati ad un mRNA non è sempre un indicatore di quanto efficientemente quel particolare mRNA viene tradotto. Infatti, ci sono contesti specifici in cui traduzione attiva su polisomi diventa stallo 21,22 che il lettore dovrebbe essere a conoscenza. Determinare se trascrizioni sono attivamente impegnati con i macchinari di traduzione può essere fatto da a) trattando il campione con puromicina, che a differenza di EDTA, provoca &#39;run-off&#39; di ribosomi che sono attivamente translocating in un mRNA, oppure b) il trattamento del campione con homoharringtonine che inibisce la traslocazione di solo il primo ribosoma al codone di inizio, di nuovo causando &#39;run-off&#39; di tutti i ribosomi translocating a valle. L&#39;uso di trascritti di controllo per l&#39;analisi qPCR è anche critico. Il Seleczione di trascrizioni che non sono affetti da diverse condizioni di trattamento come alcuni geni housekeeping (GAPDH, actina, tubulina Nucleolina), mRNA ribosomali (18S, RPL13A) o in questo caso la variante non-IRES del XIAP IRES, è importante in verificare se l&#39;effetto del trattamento sulla traduzione è specifica o generalizzata. Queste trascrizioni di controllo possono essere utilizzati per normalizzare la distribuzione dei mRNA analizzati come è stato fatto qui (XIAP e Bcl-xL mRNA sono stati normalizzati per GAPDH mRNA e espressa in percentuale del contenuto totale di mRNA rappresentato dalla somma del contenuto di mRNA in ogni frazione ) o, in alternativa, di destinazione e di controllo mRNA possono essere espressi come valori assoluti ed esposti separatamente. analisi qPCR dei lisati ingresso (solitamente il 10% del volume totale) è un altro passo che il controllo della distribuzione di specifici mRNA. Idealmente, il contenuto di un trascritto di mRNA specifico nel lisato ingresso dovrebbe essere paragonabile alla somma del contenuto di mRNA in tutte le 10 frazioni analizzati. Infine, Un passaggio facoltativo per il controllo per il fenolo: cloroformio fase di estrazione è a picco ogni frazione polisoma con un in vitro trascritto mRNA giornalista (come CAT, cloramfenicolo acetil transferasi) che verrà successivamente quantificato qPCR e può anche essere usato per normalizzare la dati 14. Come con qualsiasi tecnica, la profilatura polisoma presenta alcune limitazioni. Il fatto che di solito un minimo di 10 frazioni (cambiamenti più sottili di efficienza di traduzione può richiedere 20 o più) devono essere raccolti in modo da avere distribuzioni polisoma curato rende questo passaggio limitante, nel senso che solo un massimo di 4 campioni può essere analizzati alla volta per poter gestire comodamente estrazione dell&#39;RNA e analisi qPCR di 40 campioni e controlli di ingresso 4 alla volta. La dimensione del campione può facilmente aggiungere il passo con il numero di trascrizioni devono essere analizzati e il numero di qPCR replica di fare, e questo può essere costoso. Un altro limite di una base-qPCR polisomale profiling unnalisi è che può essere fatto solo su un approccio basato candidato (dove i trascritti da analizzare sono noti in anticipo) e non possono essere applicati per l&#39;analisi dell&#39;intero genoma di traduzione. Tuttavia, all&#39;inizio del 21 ° secolo, gli investigatori hanno cominciato a interrogare i loro RNA polisomale a livello genomico mediante DNA microarrays 15 e più recentemente con sequenziamento di prossima generazione 16,17. In questo approccio potente, profilazione polisomale viene eseguita come descritto in questo protocollo la differenza che, invece di effettuare analisi qPCR delle singole frazioni, monosomes frazioni (frazioni di solito 2-4) e polisomi frazioni (di solito frazioni) sono raggruppati insieme e variazioni nella traduzione globale analizzati da DNA microarray o dell&#39;intero genoma RNA sequencing. Quindi con questo approccio, è possibile valutare tutti gli mRNA la cui distribuzione si sposta dal polisomi a monosomes (diminuzione in traduzione) o viceversa (aumento in traduzione) su un trattamento specificomento. Validazione e quantificazione di specifica distribuzione polisomi di mRNA possono quindi essere fatto da qPCR. Un uso ancora più potente del principio polisomale profiling è profiling ribosoma. Ulteriore estensione alto rendimento di questa tecnica è stato segnalato di recente che consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di polisoma 23 frazioni. Ciò fornisce un chiaro vantaggio quando sondare l&#39;efficienza traslazionali delle collezioni mutanti o in una grande scala schermi RNAi. Profiling ribosoma è una tecnica che si avvale di sequenziamento di nuova generazione per mappare frammenti di RNA protetti da ribosomi (impronte ribosoma) impegnati nella sintesi proteica 24,25. In questa tecnica, traslocazione ribosoma può essere inibita con cicloeximide (reversibile) o emetine (irreversibile) seguita da lisi cellulare e la digestione RNasi per produrre una popolazione di impronte ribosoma. I ribosomi sono arricchiti, l&#39;RNA totale è isolato, e contaminando ribosomiale e RNA ribosomiale mitocondriale viene rimosso.Impronte di RNA di circa 26-28 nucleotidi sono isolati, a trascrizione inversa, trasformato in una libreria di cDNA e sequenziati 26. A differenza di profilazione polisoma di serie, questo approccio non solo identifica specifici mRNA che sono regolati traslazione, ma produce anche informazioni mRNA specifico per una risoluzione di codone, come l&#39;occupazione e la densità esatta di ribosomi lungo una trascrizione specifico. Ciò è particolarmente interessante per mRNA con specifiche modalità di traduzione, come mRNA IRES-ospitano, in quanto potrebbe dare più informazioni su dove sulla trascrizione ribosoma-reclutamento si sta verificando.

Regolazione della sintesi proteica (traduzione) è un processo cellulare fondamentale che è intimamente legata alla sopravvivenza cellulare. Dato che la traduzione consuma più del 50% dell&#39;energia della cellula, non è sorprendente che la traduzione è strettamente regolata e che perturbazioni in una versione non sono ben tollerati. Al contrario, molti processi cellulari aberranti richiedere che le macchine di traduzione e l&#39;uscita di traduzione (cioè proteoma) devono essere modificati. Questo è spesso il caso in vari stati di risposta allo stress e malattie, ed è probabilmente meglio esemplificato nel cancro. Uno dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la capacità delle cellule di riprogrammare rapidamente la produzione di proteine ​​in risposta a vari trigger esterni ed interni, così bene meccanismo di regolazione che consigli l&#39;equilibrio tra la sopravvivenza delle cellule e la morte 1. Due aspetti del controllo traduzionale sono particolarmente interessanti; comprensione della natura del mec normativohanism (s) ed elementi di comando che consentono una versione specifica, e l&#39;identificazione di specifici mRNA e dei loro prodotti proteici che partecipano alla risposta cellulare al particolare trigger che ha suscitato una versione selettiva in primo luogo. Profilatura polisoma è una tecnica che permette efficace studio di entrambi i processi. L&#39;obiettivo generale della tecnica polisoma profiling è quello di studiare e quantificare lo stato di traduzione di specifici mRNA in condizioni cellulari diversi. Il principio della tecnica è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA da &#39;&#39; congelamento &#39;&#39; ribosomi traducono attivamente su diversi trascritti e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo una distinzione tra trascrizioni altamente tradotte (vincolato da più ribosomi) e quindi mal quelli tradotti (vincolati da uno o due ribosomi). In questo particolare protocollo, la cicloesimmide antibiotico che si lega allaSubunità ribosomiale 60S e inibisce la produzione di deacetilato tRNA dal sito E ribosoma 2, viene utilizzato per inibire la traslocazione del ribosoma ribosomi e stallo sul mRNA traduzione. Tuttavia, altri agenti bloccanti come emetine tale definizione anche i blocchi di allungamento 3, può essere utilizzato. A differenza del western blotting e 35 S-metionina tecniche di marcatura che misurano l&#39;output finale del processo di traduzione, polisoma profilazione ha il vantaggio di misurare ribosomi associazione con mRNA attivamente tradotte, consentendo così uno studio più dettagliato di meccanismi di conversione in condizioni diverse. Quindi, la tecnica può essere facilmente adattato per studiare specificamente diverse modalità di definizione 4-6, fattori proteine ​​coinvolte nella regolazione definizione 7-9, condizioni di stress che interessano la sintesi proteica 1,10,11 o gli effetti delle strutture di mRNA come IRES oa monte aperte fasi di lettura su proteine ​​synthESIS 12-14. Al giorno d&#39;oggi, polisoma applicazioni di profilatura sono ancora più ampia con l&#39;uso di DNA microarray 15 o sequenziamento di prossima generazione 16,17 per analizzare polisomi-associati mRNA.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regolazione della sintesi proteica rappresenta un punto di controllo chiave nella risposta cellulare allo stress. In particolare, RNA discreto elementi regolatori sono stati mostrati per permettere alla traduzione selettiva di specifici mRNA che codificano per proteine ​​tipicamente richiesti per una particolare risposta allo stress. L&#39;identificazione di questi mRNA, così come la caratterizzazione dei meccanismi di regolamentazione responsabili della traduzione selettiva è stata in prima linea di biologia molecolare per qualche tempo. Profiling polisoma è un metodo pietra miliare in questi studi. L&#39;obiettivo di polisoma profiling è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA immobilizzando ribosomi traducono attivamente diverse trascrizioni e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo così una distinzione tra trascrizioni altamente tradotti e quelli mal tradotti. Questi possono poi essere ulteriormente caratterizzate da metodi tradizionali biochimica e biologia molecolare. È importante sottolineare che, combinando polysome profilatura con approcci genomici ad alto rendimento consente una vasta analisi di scala di regolazione traduzionale.

Abbiamo recentemente descritto un nuovo ruolo per il tumore soppressore PDCD4 come un inibitore selettivo di traduzione degli mRNA codificanti inibitori di apoptosi XIAP e Bcl-xL 12 IRES-ospitare. Profiling polisoma era una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico di PDCD4 nella traduzione IRES-mediata. HEK293 cellule sono state trasfettate per esaurire i livelli endogeni di PDCD4 (Figura 1A) e poi sottoposti ad polisoma analisi del profilo. Abbiamo osservato che la riduzione dei livelli di PDCD4 non ha compromesso la traduzione globale cellulare, come giudicato dalla mancanza di cambiamenti nel profilo polisoma quando si confrontano i siCTRL e siPDCD4 cellule trattate (Figura 1B). Allo stesso modo, polisoma distribuzione di non-IRES variante di XIAP 19 è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). Al contrario, polisoma distribuzione dei mRNA due IRES-ospitano, XIAP e Bcl-xL, è risultata significativamente modificata. In assenza di PDCD4 la distribuzione di questi due mRNA viene spostata in ribopolysomes pesanti (Figura 1D, E). Dal momento che questo non è accompagnato da variazioni dei livelli di steady-state di XIAP e Bcl-xL mRNA (Figura 1F) Questi risultati dimostrano una maggiore traduzione di XIAP e Bcl-xL in cellule con livelli PDCD4 ridotti, che è stato ulteriormente confermato mediante Western blotting (Figura 1G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Profiling polisoma identifica PDCD4 come inibitore selettivo della traduzione XIAP e Bcl-xL (A) HEK293 cellule sono state trattate con PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL), non-targeting siRNA, lisati e sottoposti ad analisi Western blot con anti-PDCD4 e gli anticorpi anti-nucleolina per verificare il grado di PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 è stato abbattuto come in (A) eI lisati cellulari sono stati sottoposti a polisoma profilatura. Profilo polisoma Rappresentante è mostrato nel pannello superiore; distribuzione del XIAP non IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) mRNA relativi a quella della GAPDH è mostrato come la percentuale di mRNA totale (% mRNA) di ogni frazione. (F) fissa livelli di mRNA -state sono stati misurati mediante RT-qPCR in PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL) siRNA cellule trattate. (G) I lisati da (A) sono stati anche sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi anti-XIAP, anti-Bcl-xL, e anticorpi anti-nucleolina. (NB. I dati presentati nella figura 1 sono stati originariamente pubblicati in 12) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Views.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Video: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Ricerca

Biochimica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Biologia dello sviluppo

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biologia

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...