La difficulté avec une substitution de résidu unique est de génotyper efficacement les animaux malgré la différence entre les résidus uniques. L’utilisation spéciale d’une enzyme de restriction n’ajoute qu’une seule étape rapide et peu coûteuse au génotypage typique basé sur la PCR. Ce protocole peut être appliqué à n’importe quel autre modèle murin avec un point de mutation si la séquence cible est reconnue par une enzyme de restriction, ce qui est généralement le cas.
Coupez un à trois millimètres de l’extrémité de la queue avec des ciseaux propres et transférez-le dans un tube PCR à huit bandes de 0,2 millilitre. Après avoir contenu l’échantillon de queue tel que décrit dans le manuscrit, conservez-le à T-moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’extraction, jusqu’à environ une semaine. Ajouter 100 microlitres de solution de lyse tissulaire par tube et bien mélanger, puis faire tourner à l’aide d’une minicentrifugeuse de table à 2 200 fois G pendant 10 secondes à température ambiante.
Assurez-vous que les échantillons de queue sont immergés dans la solution. Réglez les tubes sur un cycleur thermique en programmant les paramètres de lyse tissulaire, d’inactivation et de maintien. Conservez le lysat tissulaire à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine si la PCR ne peut pas être effectuée immédiatement.
Préparer une solution pcR contenant cinq microlitres d’eau sans nucléase, 0,75 microlitres d’amorces avant et arrière de 10 micromolaires et 7,5 microlitres de mélange maître PCR par échantillon dans un nouveau tube PCR. Ajouter un microlitre du lysat tissulaire préalablement préparé à la solution PCR. Mélangez bien la solution PCR et faites tourner vers le bas avec une minicentrifugeuse de table à 2 200 fois G pendant 10 secondes à température ambiante.
Placez les tubes sur un cycleur thermique programmé. Une fois la réaction terminée, conservez les produits pcR à quatre degrés Celsius pendant un à deux mois ou environ un an à moins 20 degrés Celsius. Préparer la solution enzymatique contenant sept microlitres d’eau sans nucléase, deux microlitres de tampon CutSmart à une force de 10X et un microlitre d’enzyme de restriction NlaIII.
S’il y a plusieurs échantillons, multipliez chaque contenu pour faire le mélange et aliquote 10 microlitres par tube. Ajouter 10 microlitres de produit PCR préalablement obtenu à la solution enzymatique par tube. Mélangez bien et tournez avec la minicentrifugeuse de table comme démontré précédemment.
Placez les tubes sur un cycleur thermique programmé ou un bloc thermique. Conservez le produit après l’incubation dans des conditions froides. Ajouter 0,75 gramme d’agarose dans 50 millilitres de tampon TAE à force unique.
Mélanger et chauffer l’agarose au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle se dissout complètement. Après l’avoir refroidi, ajoutez cinq microlitres de tache d’ADN et mélangez doucement. Versez 25 millilitres de gel d’agarose dans le moule en gel et laissez le gel se solidifier.
Chargez 10 microlitres de produit PCR digéré dans le puits. Faites fonctionner le gel avec 100 volts pendant 35 minutes. Imagez le gel d’agarose sous lumière ultraviolette.
L’électrophorèse de l’agarose réalisée à l’aide du produit PCR digéré a donné plusieurs bandes de tailles différentes dans chaque génotype, avec deux bandes de type sauvage, trois chez les hétérozygotes et une chez les homozygotes, respectivement. L’injection test avec analyse de blastocyste a donné un taux de réussite de 76,9% sur l’injection de 50 nanogrammes par microlitre des oligos donneurs, et un taux de réussite de 25% sur l’injection de 25 nanogrammes par microlitre des mêmes oligos donneurs, respectivement. Enfin, l’injection de 50 nanogrammes par microlitre des oligos donneurs avec une précipitation d’éthanol a permis d’obtenir des animaux fondateurs avec un taux de réussite de 50%.
La purification des oligo-donneurs par précipitation d’éthanol a réduit la toxicité tout en conservant une efficacité élevée d’édition du génome. Une manipulation prudente et l’ajout d’une faible quantité de réactifs sont très importants. Assurez-vous qu’ils sont correctement ajoutés et qu’ils sont bien mélangés.
