هنا ، نوضح بروتوكولنا الخاص بعزل الخلايا الجيبية الأولية لكبد الفأر أو عزل LSECs. يتكون البروتوكول من تروية كولاجيناز الكبد والطرد المركزي الفائق السرعة منخفض السرعة لتنقية الخلايا غير المتنية واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. طريقة عزل LSEC الخاصة بنا فعالة للغاية وقابلة للتطبيق على كبد الفأر الصحي والمريض.
تعرض LSECs المعزولة نقاء عاليا وتحافظ على الهيكل والوظيفة. تعتبر LSECs المعزولة باستخدام هذا البروتوكول مثالية للدراسات الوظيفية والجزيئية وتوليد البيانات متعددة الأوميك. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لدراسة الاتصال بين الخلايا في الكبد.
ابدأ بطلاء أطباق الثقافة التي يبلغ طولها 10 سنتيمترات بثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجين. ثم ، احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة ، قم بإزالة السائل الزائد من السطح المطلي.
اغسل الأطباق باستخدام PBS ثلاث مرات واتركها لتجف في الهواء. قم بإعداد جهاز إعادة التدوير الساخن والرطب. شطف نظام التروية باستخدام 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق.
ثم اشطف النظام مرة أخرى بالماء المعقم لمدة 10 دقائق أخرى. صفي سائل الشطف قدر الإمكان قبل دمجه بمحلول الكولاجيناز. غرس محلول الكولاجيناز من خلال نظام التروية لتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
اضبط معدل المضخة على سرعة واحدة على قرص التحكم في السرعة. حافظ على السرعة كما هي طوال الإجراء بأكمله. وزن الماوس لهذا الإجراء.
ثم قم بتأمينه على السطح الجراحي. رش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق يبلغ طوله حوالي خمسة سنتيمترات بدءا من الجزء السفلي من البطن حتى عملية الخنازير.
بعد ذلك ، قم بإجراء قطعتين جانبيتين باستخدام مقص قزحية صغير على كل جانب من جوانب البطن لكشف أعضاء البطن بالكامل. ضع غمد القسطرة الوريدية تحت ظهر الحيوان لرفع البطن وتسويته. باستخدام ملقط ضمادة منحني منتظم ، اسحب الأمعاء والمعدة بلطف إلى يسار الحيوان.
ثم ، ضع خياطة جراحية 5-0 تحت الوريد الأجوف السفلي ، أو IVC ، أسفل الكلى اليسرى المكشوفة مباشرة. اربط وصلة فضفاضة في الخياطة. بعد ذلك ، ضع خياطة جراحية أخرى 5-0 حول الوريد البابي الكبدي.
ضع الخيط فوق نقطة تفرع الوريد الطحالي مباشرة في الوريد البابي الكبدي. مرة أخرى ، اربط عقبة فضفاضة في الخياطة. باستخدام خياطة الوريد البابي كشد ، أدخل القسطرة الوريدية ذات المقياس 20 في الوريد البابي الكبدي على بعد سنتيمتر واحد أدناه حيث تتفرع إلى الوريد البابي الكبدي الأيمن والأيسر.
ثم، حرك القسطرة لأعلى الوريد، ولكن احتفظ بها أسفل منطقة التفرع. اسمح للدم بالانتقال إلى أسفل القسطرة حتى يبدأ في التنقيط. قم بتأمين القسطرة الوريدية باستخدام خياطة الوريد البابي.
استخدم خطا IV لتوصيل زجاجة IV مع المخزن المؤقت A بالقسطرة. ثم اغسل الكبد بهذا المحلول مع تجنب دخول الهواء إلى النظام. اربط الخيط حول IVC أسفل الكلى.
بعد ذلك ، قم بقطع IVC أسفل الخيط للسماح للحيوان بالنزيف. بمجرد التعطير ، اقطع المعدة والأمعاء والطحال والأحشاء الأخرى المرتبطة بالكبد. ثم ، قطع الحجاب الحاجز والأوعية الرئيسية من التجويف الصدري.
إزالة الكبد من الحيوان ووضعه على صينية التروية. قم بإزالة الخط الوريدي بعناية وقم بتوصيل محلول الكولاجيناز في غرفة إعادة التدوير. اسمح للكبد بالنفاذ حتى تصبح الكبسولة نموذجية وتبدو طرية.
يجب أن يستغرق هذا عادة من 10 إلى 15 دقيقة. بمجرد هضمه ، قم بإزالة الكبد من الغرفة وضعه على طبق بتري بطول 10 سم مع حوالي 20 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل. اختر الكبد بلطف مع اثنين من نصائح الماصة وتخلص من الشجرة الصفراوية.
بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الكبد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 50 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ثم ، جمع supernatant التي تحتوي على خلايا كبدية غير متني.
جهاز الطرد المركزي الفائق عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بجمع حبيبات الخلية وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من العازلة المؤقتة. حدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية تلقائي باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
بعد ذلك ، الطرد المركزي تعليق الخلية. قم بشفط السوبرناتانت بالكامل وإعادة تعليق الكريات مع 90 ميكرولتر من العازل العازل لكل 10 ملايين خلية. أضف 10 ميكرولترات من CD146 MicroBeads لكل 10 ملايين خلية إجمالية.
اخلطيها جيدا واحتضنيها لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لغسل الخلايا ، أضف واحدا إلى ملليلترين من العزل العازل لكل 10 ملايين خلية. الطرد المركزي الحل في 300 مرات G لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، قم بشفط supernatant بالكامل وإعادة تعليق ما يصل إلى مليار خلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل. بعد ذلك ، قم بإعداد عمود الفصل عن طريق شطفه بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للعزل. ضع تعليق الخلية على العمود المكدس بمرشحات الفصل المسبق التي تبلغ سعتها 70 ميكرومتر.
اغسل العمود بثلاثة ملليلترات من العزل المؤقت ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. ماصة خمسة ملليلترات من العزل العازلة على العمود.
لاستعادة الخلايا الموسومة بالخرز المغناطيسي ، ادفع المكبس بقوة إلى العمود لطرد الخلايا. وأخيرا، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تم تقييم نقاء LSECs المعزولة وعلامات السطح باستخدام قياس التدفق الخلوي.
يعتمد تحليل البيانات واستراتيجية البوابات ل LSECs المسورة والمفردات على بيانات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. تم تلطيخ LSECs المعزولة بصبغة قابلة للحياة ومزيج من الأجسام المضادة CD45 و CD146 و Stabilin-2. تم وضع بوابات LSECs القابلة للحياة على السكان السلبيين CD45 وتحليلها لتعبير CD146 و Stabilin-2.
من هذه البيانات ، تم التأكيد على أن LSECs المعزولة لديها قابلية أكبر من 94٪ قابلة للحياة وأكبر من 90٪ نقاء. كما تم تأكيد النمط الظاهري الخاص ب LSEC للخلايا المعزولة باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني الماسح. تم استزراع LSECs المعزولة في وسط النمو الكامل لمدة ست ساعات وفحصها بواسطة الفحص المجهري الخفيف.
تشير الأسهم البيضاء في صورة SEM إلى LSEC fenestrae ، وهي سمة مورفولوجية مميزة ل LSECs. الخطوات الحاسمة لضمان التروية الكاملة لأنسجة الكبد هي تحديد موضع شريط القسطرة المناسب ، وتجنب إدخال الهواء في القسطرة ، والتوقيت الأمثل لهضم الكولاجيناز. إن LSEC عالي الجودة الذي تم الحصول عليه باستخدام بروتوكولنا سيسهل تحديد الآلية الجزيئية لوظيفة LSEC وسيحسن فهمنا لدورها في التواصل بين الخلايا في الكبد والصحة والمرض.
