I tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina o FFPE sono spesso miscele di materiali tumorali e non tumorali, in cui la presenza di materiale non tumorale è spesso indesiderata e può, se presente in proporzione elevata, avere un impatto significativo sui risultati dell'analisi genomica, quindi il principale vantaggio della macro-dissezione rispetto al lavoro con tessuti non resecati è che le sezioni di tessuto resecato deparaffinizzato risultanti possono essere raccolte per l'estrazione di RNA e DNA, che può quindi essere utilizzato con sicurezza nell'analisi genomica a valle. Sapendo che i materiali estratti sono derivati da tessuti con un contenuto tumorale migliorato con contributi minimi dalla contaminazione dei tessuti non tumorali. Il flusso di lavoro in più fasi di questo processo sarà dimostrato da Mr.Lee Wisner, Dr.Brandon Larsen e da me stesso In preparazione per il sezionamento dei tessuti, presaak i blocchi di paraffina su acqua ghiacciata per 10-15 minuti.
Raffreddare i blocchi indurisce la cera mentre l'acqua inumidisce il tessuto, che insieme rende più facile il taglio del tessuto. Mentre i blocchi sono sul ghiaccio, etichettare i vetrini del microscopio in modo appropriato. Riempire e riscaldare il bagno d'acqua a 39 gradi Celsius e impostare il microtomo sullo spessore di taglio desiderato.
Caricare con attenzione la lama sul microtomo. Blocca la lama in posizione e posiziona la protezione di sicurezza fino a quando non sei pronto per iniziare a sezionare i blocchi. Mentre la protezione di sicurezza è in posizione, inserire il blocco FFPE nel mandrino microtome.
Per iniziare, sezionare lentamente il blocco fino a ottenere una sezione a faccia intera. Questo è noto come affrontare il blocco. Una volta raggiunto questo obiettivo, il blocco può essere in sezione più velocemente per ottenere un nastro di sezioni.
Una volta tagliato, trasferire il nastro di sezioni di tessuto al bagno di acqua calda. Utilizzare una pinza per separare una singola sezione di tessuto dal nastro. Per fare ciò, posizionare il retro della pinza curva chiusa sul giunto tra le due sezioni e consentire alla pinza di aprirsi delicatamente per separare le sezioni.
Raccogliere la sezione di tessuto isolato su un vetrino per microscopio. Per evitare di intrappolare le bolle, inserire il vetrino del microscopio nell'acqua ad angolo. Agitare delicatamente il vetrino per rimuovere l'acqua in eccesso prima di metterlo sul rack per asciugare all'aria.
Una volta asciutto, selezionare almeno una delle sezioni di tessuto appena tagliate per la colorazione di ematossilina ed eosina, nota anche come colorazione H ed E.Once, inviare il vetrino H ed E per la revisione della patologia. Durante la revisione della patologia, un patologo esperto esamina i vetrini di colorazione H ed E per determinare dove si trova il tessuto di interesse in ciascun tessuto. Il patologo esamina prima l'intero tessuto per determinare dove risiedono i tessuti di interesse all'interno del tessuto.
Una volta completata l'istologia iniziale e la revisione morfologica, il patologo utilizza una penna di marcatura del vetrino per annotare ogni vetrino colorato H ed E. Usando il marcatore, il patologo disegna un cerchio attorno al tessuto di interesse, escludendo il tessuto che non è di interesse. Questo processo di revisione viene quindi ripetuto per tutte le diapositive colorate H ed E nel progetto.
Impostare l'area di lavoro del banco di macro-dissezione che consente di gestire ogni campione in modo sequenziale ed efficiente. Per ogni campione, devono essere a portata di mano le corrispondenti sezioni di tessuto montate su vetrino non macchiate, nonché i microtubi premarcati contenenti il tampone di digestione per la raccolta dei tessuti. Caricare le diapositive non macchiate in un rack e procedere alla cappa aspirante per la deparaffinazione.
Deparaffinizzare i vetrini immergendo i vetrini in due lavaggi sequenziali di D-limonene non diluito o CitriSolv seguiti da un lavaggio finale in etanolo al 100% per due minuti per lavaggio. All'inizio di ogni lavaggio, agitare delicatamente il lavaggio per circa cinque-10 secondi. Per ridurre al minimo il riporto tra i lavaggi, lasciare che i vetrini si scarichino brevemente e tamponare il rack sul tovagliolo di carta.
Dopo i tre lavaggi, i tessuti sono ora altamente visibili sui vetrini del microscopio. Lasciare asciugare all'aria le diapositive per 10 minuti. Una volta asciutti, l'H e l'E vengono quindi posizionati a faccia in giù sul banco e il tessuto deparaffinato posto sopra, anche a faccia in giù, allineando il tessuto deparaffinizzato con l'H e l'E.Una volta correttamente allineati, l'area tumorale contrassegnata dal patologo sull'H e sull'E viene tracciata sul retro del vetrino della sezione di tessuto deparaffinato.
I vetrini non macchiati ora contrassegnati sono immersi in una soluzione di glicerolo al 3% per ridurre al minimo la statica e aiutare la raccolta dei tessuti. Rimuovere lentamente i vetrini immersi per ridurre al minimo la quantità di soluzione di glicerolo che si aggrappa al vetrino immerso. Una volta rimosso, pulire il retro del vetrino e tutte le aree prive di tessuti sulla parte anteriore del vetrino per rimuovere il glicerolo in eccesso.
Successivamente, utilizzando una lama pulita, tracciare i segni patologici con la lama per interrompere la connessione tra il tessuto di interesse e il resto del tessuto. Notando che questo passaggio può essere fatto prima dell'immersione del glicerolo, in particolare se i segni patologici sono complessi in quanto il taglio del tessuto secco può essere più facile e può anche ridurre al minimo il rischio di resistenza dei tessuti. Il tessuto al di fuori dei segni patologici non è di interesse.
Questi vengono rimossi utilizzando il bordo piatto della lama, assicurandosi che l'angolo della lama agganci l'esterno dei segni patologici. Una volta rimosso il tessuto indesiderato, viene utilizzata una nuova lama per raccogliere il tessuto di interesse. Il tessuto raccolto viene quindi rimosso dalla lama utilizzando l'estremità piatta di un bastoncino di legno e quindi trasferito in un microtubo pre-marcato con tampone di digestione, completando così l'arricchimento del tessuto tumorale mediato dalla macro-dissezione, che ora sono pronti per l'estrazione di acido nucleico.
Per dimostrare come la macro-dissezione può influenzare l'analisi genomica a valle, le sezioni tissutali di cinque linfomi diffusi a grandi cellule B, o DLBCL, con diverso contenuto tumorale sono state macro-sezionate o non macro-sezionate. Le estrazioni di acido nucleico sono state eseguite sui tessuti raccolti e l'RNA risultante esaminato utilizzando il test di profilo di espressione genica digitale DLBCL90, noto anche come test di firma a doppio colpo. DLBCL è composto da tre distinti sottotipi molecolari, vale a dire GCB, ABC e il loro sottotipo intermedio indicato non classificato, che può essere determinato utilizzando il test DLBCL90.
Questo test è anche in grado di identificare i tumori DLBCL che ospitano traslocazioni a doppio colpo che coinvolgono il gene BCL2. I risultati di DLBCL 90 sono mostrati in questa tabella. I campioni macro-sezionati sono stati eseguiti due volte.
Una volta usando la loro concentrazione di stock di RNA e una volta usando lo stock di RNA diluito per abbinare la concentrazione delle rispettive controparti non sezionate macro. I risultati mostrano che la macro-dissezione ha provocato cambiamenti di sottotipo o chiamata a doppio colpo in tre dei cinque campioni. La macro-dissezione del campione A non ha avuto alcun effetto sulla chiamata del sottotipo, ma ha cambiato la chiamata a doppio colpo da negativa a non classificata, e questo cambiamento è stato osservato indipendentemente dall'input di RNA del campione macro-sezionato.
Al contrario, la macro-dissezione del campione C non ha avuto alcun effetto sulla chiamata a doppio colpo, ma ha cambiato la chiamata del sottotipo da GCB a non classificata, che è stata osservata anche indipendentemente dall'input di RNA del campione macro-sezionato. Analogamente al campione A, la macro-dissezione del campione E non ha avuto alcun effetto sulla chiamata del sottotipo, ma ha cambiato la chiamata a doppio colpo. Tuttavia, per il campione E, la chiamata è cambiata da non classificata a negativa e, ancora una volta, lo ha fatto indipendentemente dall'input di RNA del campione macro-sezionato.
In particolare, questa chiamata cambiata in negativo a doppio colpo ha senso biologico dato che il campione E è risultato essere ABC e le traslocazioni a doppio colpo che coinvolgono BCL2 sono state segnalate per essere osservate esclusivamente nei tumori GCB. Insieme, questi risultati evidenziano l'importanza della purezza del tumore e dei saggi genomici e della macro-dissezione come strumento affidabile per raggiungere questo obiettivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di cosa sia la macro-dissezione, l'importanza della revisione patologica e i benefici dello studio ottenuti includendo la macro-dissezione nel flusso di lavoro di gestione dei tessuti.
