Les tissus incorporés à la paraffine fixée au formol ou FFPE sont souvent des mélanges de matériaux tumoraux et non tumoraux, où la présence de matériel non tumoral est souvent indésirable et peut, si elle est présente à une proportion élevée, avoir un impact significatif sur les résultats de l’analyse génomique, de sorte que le principal avantage de la macro-dissection par rapport au travail avec des tissus non réséqués est que les sections de tissus réséqués déparaffinés qui en résultent peuvent être collectées pour l’extraction de l’ARN et de l’ADN, qui peut ensuite être utilisé en toute confiance dans l’analyse génomique en aval. Sachant que les matériaux extraits sont dérivés de tissus à teneur tumorale améliorée avec des contributions minimales de tissus non tumoraux contaminants. Le flux de travail en plusieurs étapes de ce processus sera démontré par M. Lee Wisner, le Dr Brandon Larsen et moi-même En préparation du sectionnement des tissus, présouter les blocs de paraffine sur de l’eau glacée pendant 10 à 15 minutes.
Refroidir les blocs durcit la cire tandis que l’eau humidifie le tissu, ce qui facilite la coupe du tissu. Pendant que les blocs sont sur la glace, étiquetez les lames du microscope de manière appropriée. Remplissez et chauffez le bain-marie à 39 degrés Celsius et réglez le microtome à l’épaisseur de coupe souhaitée.
Chargez soigneusement la lame sur le microtome. Verrouillez la lame en place et placez le protecteur de sécurité jusqu’à ce que vous soyez prêt à commencer à sectionner les blocs. Pendant que le protecteur de sécurité est en place, insérez le bloc FFPE dans le mandrin du microtome.
Pour commencer, coupez le bloc lentement jusqu’à ce qu’une section de face complète soit obtenue. C’est ce qu’on appelle faire face au bloc. Une fois que cela est réalisé, le bloc peut être en section plus rapidement pour obtenir un ruban de sections.
Une fois coupé, transférez le ruban de sections de tissu au bain d’eau tiède. Utilisez une pince pour séparer une seule section de tissu du ruban. Pour ce faire, placez l’arrière des pinces incurvées fermées au niveau du joint entre les deux sections et laissez les pinces s’ouvrir doucement pour séparer les sections.
Prélever la section de tissu isolé sur une lame de microscope. Pour éviter de piéger les bulles, insérez la lame du microscope dans l’eau en un angle. Secouez doucement la glissière pour éliminer l’excès d’eau avant de la placer sur la grille pour sécher à l’air.
Une fois sec, sélectionnez au moins une des sections de tissu fraîchement coupées pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, également connue sous le nom de H et E.Une fois taché, soumettez la lame H et E pour examen pathologique. Au cours de l’examen de la pathologie, un pathologiste expert examine les lames de coloration H et E pour déterminer où se trouve le tissu d’intérêt dans chaque tissu. Le pathologiste examine d’abord l’ensemble du tissu pour déterminer où les tissus d’intérêt résident dans le tissu.
Une fois l’examen initial de l’histologie et de la morphologie terminé, le pathologiste utilise un stylo de marquage de diapositive pour annoter chaque lame colorée en H et E. À l’aide du marqueur, le pathologiste dessine un cercle autour du tissu d’intérêt, excluant le tissu qui n’est pas d’intérêt. Ce processus d’examen est ensuite répété pour toutes les diapositives colorées H et E du projet.
Configurez l’espace de travail du banc de macro-dissection qui permet de gérer chaque échantillon de manière séquentielle et efficace. Pour chaque échantillon, les H et E pathologiquement examinés, les sections de tissus montées sur lame non colorées correspondantes, ainsi que les microtubes pré-marqués contenant le tampon de digestion pour la collecte de tissus doivent être à portée de main. Chargez les glissières non colorées dans un rack et dirigez-vous vers la hotte pour la déparaffinisation.
Déparaffinez les lames en les immergeant dans deux lavages séquentiels de D-limonène ou de CitriSolv non dilués, suivis d’un lavage final dans de l’éthanol à 100% pendant deux minutes par lavage. Au début de chaque lavage, agitez doucement le lavage pendant environ cinq à 10 secondes. Pour minimiser le report entre les lavages, laissez les glissières s’écouler brièvement et tamponnez le rack sur l’essuie-tout.
Après les trois lavages, les tissus sont maintenant très visibles sur les lames du microscope. Laissez les glissières sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Une fois sec, le H et le E sont ensuite placés face cachée sur le banc et le tissu déparaffinisé placé sur le dessus, également face vers le bas, alignant le tissu déparaffinisé avec le H et l’E.Une fois correctement aligné, la zone tumorale marquée par le pathologiste sur le H et E est tracée à l’arrière de la lame de section de tissu déparaffinisé.
Les lames non colorées maintenant marquées sont trempées dans une solution de glycérol à 3% pour minimiser l’électricité statique et faciliter la collecte de tissus. Retirez lentement les lames trempées pour minimiser la quantité de solution de glycérol qui s’accroche à la lame trempée. Une fois retiré, essuyez l’arrière de la lame et toutes les zones sans tissu à l’avant de la lame pour éliminer l’excès de glycérol.
Ensuite, à l’aide d’une lame propre, tracez les marques de pathologie avec la lame pour rompre la connexion entre le tissu d’intérêt et le reste du tissu. Notant que cette étape peut être effectuée avant le trempage du glycérol, en particulier si les marques pathologiques sont complexes car couper les tissus secs peut être plus facile et peut également minimiser le risque de traînée tissulaire. Les tissus en dehors des marques de pathologie ne sont pas d’intérêt.
Ceux-ci sont enlevés à l’aide du bord plat de la lame, en s’assurant que le coin de la lame accroche l’extérieur des marques de pathologie. Une fois que le tissu indésirable est retiré, une nouvelle lame est utilisée pour collecter le tissu d’intérêt. Le tissu collecté est ensuite retiré de la lame à l’aide de l’extrémité plate d’un bâton en bois, puis transféré dans un microtube pré-marqué avec tampon de digestion, complétant ainsi l’enrichissement du tissu tumoral médié par macro-dissection, qui sont maintenant prêts pour l’extraction des acides nucléiques.
Pour démontrer comment la macro-dissection peut affecter l’analyse génomique en aval, des coupes de tissus de cinq lymphomes diffus à grandes cellules B, ou LDGCB, avec des contenus tumoraux différents ont été macro-disséquées ou non macro-disséquées. Des extractions d’acides nucléiques ont été effectuées sur les tissus prélevés et l’ARN résultant a été examiné à l’aide du test de profilage numérique de l’expression génique DLBCL90, également connu sous le nom de test de signature à double succès. Le LDGCB est composé de trois sous-types moléculaires distincts, à savoir GCB, ABC, et leur sous-type intermédiaire noté non classifié, qui peut être déterminé à l’aide du test DLBCL90.
Ce test est également capable d’identifier les tumeurs du LDGCB qui abritent des translocations à double impact impliquant le gène BCL2. Les résultats de la DLBCL 90 sont présentés dans ce tableau. Des échantillons macro-disséqués ont été exécutés deux fois.
Une fois en utilisant leur concentration de stock d’ARN et une fois en utilisant le stock d’ARN dilué pour correspondre à la concentration de leurs homologues respectifs non macro-disséqués. Les résultats montrent que la macro-dissection a entraîné des changements de sous-type ou d’appel à double succès dans trois des cinq échantillons. La macro-dissection de l’échantillon A n’a eu aucun effet sur l’appel de sous-type, mais a changé l’appel à double succès de négatif à non classifié, et ce changement a été observé indépendamment de l’entrée d’ARN de l’échantillon macro-disséqué.
En revanche, la macro-dissection de l’échantillon C n’a eu aucun effet sur l’appel à double succès, mais a changé l’appel de sous-type de GCB en non classifié, ce qui a également été observé indépendamment de l’entrée d’ARN de l’échantillon macro-disséqué. Semblable à l’échantillon A, la macro-dissection de l’échantillon E n’a eu aucun effet sur l’appel de sous-type, mais a modifié l’appel à double accès. Cependant, pour l’échantillon E, l’appel est passé de non classifié à négatif, et encore une fois, l’a fait indépendamment de l’entrée d’ARN de l’échantillon macro-disséqué.
Notamment, cet appel changé en double coup négatif est biologiquement logique étant donné que l’échantillon E s’est avéré être ABC et que des translocations à double succès impliquant BCL2 ont été signalées comme étant exclusivement observées dans les tumeurs GCB. Ensemble, ces résultats soulignent l’importance de la pureté tumorale et des tests génomiques et de la macro-dissection en tant qu’outil fiable pour y parvenir. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de ce qu’est la macro-dissection, de l’importance de l’examen pathologique et des avantages de l’étude obtenus en incluant la macro-dissection dans votre flux de travail de manipulation des tissus.
