Questo protocollo è significativo perché dimostra, come preparare nanoparticelle polimeriche, acidi nucleici incapsulati in un semplice passaggio. I principali vantaggi di questa tecnica sono la versatilità, in quanto può essere applicata a diversi acidi nucleici e tipi di cellule. L'uso di semplici procedure per la preparazione delle particelle, come il pipettaggio su e giù, e la possibilità di estendere la stabilità delle nanoparticelle e delle condizioni del tamburo mediante liofilizzazione.
A dimostrare la procedura saranno Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto e Maria Navalon-Lopez, dottoranda del nostro laboratorio e Marta Diaz-Caballero, post doc per il nostro laboratorio. Per la formazione di poliplexi, scongelare i polimeri precedentemente preparati, il peptide C6, gli amminosteri poli beta e vorticare la soluzione. Dopo aver pipettato la miscela polimerica su e giù, preparare una soluzione da 12,5 millimolari in acetato di sodio.
Vortice la soluzione e attendere 10 minuti. Quindi, preparare l'mRNA a 0,5 milligrammi per millilitro e miscelato mediante pipettaggio. Ruotare nuovamente la soluzione polimerica, quindi mescolare la soluzione di materiale genetico nella soluzione polimerica in un rapporto uno a uno in un tubo di micro centrifuga e incubare il tubo a 25 gradi Celsius per 30 minuti in un thermoblock.
Dopo l'incubazione precipitare la miscela con uno o due acqua priva di RNasi aggiungendo il campione a una micro provetta di centrifuga contenente l'acqua, quindi per includere gli eccipienti, aggiungere un cumulo di 20 millimolari e una soluzione di saccarosio al 4% nello stesso volume della miscela di mRNA e amminoesteri poli beta e miscelati mediante pipettaggio. Per la liofilizzazione dopo aver congelato la soluzione di poliplex a meno 80 gradi Celsius per un'ora, eseguire l'essiccazione primaria, quindi conservare immediatamente i poliplexi a meno 20 gradi Celsius per evitare la reidratazione. Per la risospensione poliplex, rimuovere le nanoparticelle liofilizzate dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e aggiungere rapidamente la quantità corrispondente di acqua idrogenata profonda per disperdere nuovamente il solido e raggiungere la concentrazione desiderata.
Pipettare delicatamente fino alla totale risospensione e una volta sciolto, pipettare su e giù vigorosamente evitando bolle. Dopo 24 ore di trasfezione per la valutazione qualitativa mediante microscopia a fluorescenza, posizionare la piastra a 96 pozzetti contenente le cellule Hela trasfettate al microscopio e iniziare a visualizzare utilizzando l'obiettivo 10 volte. Innanzitutto, applica un bilanciamento del bianco per creare un riferimento di sfondo per il software, quindi acquisisci un'immagine per sovrapporla all'immagine a fluorescenza durante l'analisi.
Cambiare la modalità microscopio in modalità di riflessione e spostare la ruota del filtro sul laser blu per visualizzare EGFP. Quindi acquisire immagini per tutte le condizioni o pozzi che impiegano lo stesso tempo di esposizione. Per la valutazione quantitativa mediante citometria a flusso, lavare le cellule Hela trasfettate in una piastra a 96 pozzetti utilizzando 100 microlitri di PBS per pozzetto.
Dopo aver aspirato il PBS a 25 microlitri di tripsina per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Una volta staccate le cellule, aggiungere il supporto precedentemente recuperato per inattivare la tripsina, quindi fissare le cellule aggiungendo 31,25 microlitri del 10% di formalina per pozzetto e incubando per 20 minuti. Quindi accendere il citometro a flusso e il software, quindi impostare le condizioni corrette per l'esperimento, incluso il tipo di volume del campione di piastra e altri parametri come l'agitazione e il risciacquo tra i campioni.
Impostare i parametri appropriati per quantificare la percentuale di cellule trasfettate positivamente visualizzando prima i dati di flusso sulla luce diffusa in avanti rispetto alla luce diffusa laterale per distinguere le celle dai detriti. E poi tracciare un altro grafico a dispersione, confrontando l'ampiezza rispetto all'altezza per gate e discriminare le singole celle. Un giorno prima della trasfezione, piastra 10.000 cellule JAWS II per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti per l'incubazione notturna.
Il giorno seguente trasfettate le cellule con 0,6 microgrammi di mRNA per pozzetto e incubare la piastra per 24 ore in un incubatore ad aria secca a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo, lavare le cellule rimaste nel pozzo con 25 microlitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS a 25 microlitri di tripsina e incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare le cellule.
Fermare la reazione della tripsina aggiungendo il supporto precedentemente recuperato sul corrispondente bene. Quindi centrifugare la piastra, aspirare il mezzo e fissare le celle aggiungendo 50 microlitri di PBS e il 2,5% di formalina per pozzetto, quindi incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 20 minuti, centrifugare la piastra. Quindi aggiungere 50 microlitri di PBS e 3% BSA per pozzetto e incubatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione centrifugare nuovamente la piastra, quindi aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo ovalbumina del topo in PBS e 3% BSA e incubatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere la fase di centrifugazione, quindi lavare le celle con 50 microlitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere gli anticorpi secondari e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio. Quindi risospese le cellule e 100 microlitri di PBS e 2,5% formalina per l'analisi della citometria a flusso. La caratterizzazione fisiochimica di nanoparticelle di mRNA GFP freschi e liofilizzati che incapsulano nanoparticelle non mostra differenze significative nelle dimensioni e nell'indice di polidisperibilità.
La microscopia elettronica a trasmissione dei poliplex conferma la formazione di nanoparticelle sferiche e mono disperse di circa 50 nanometri di diametro. I dati sull'efficienza di incapsulamento di un peptide Lego e di poliplexi di poli beta-estere modificato che incapsulano GFP o ovalbumina non mostrano differenze significative a seconda del tipo di mRNA. Un'analisi qualitativa dell'espressione EGFP, 24 ore dopo la transazione nella linea cellulare JAWS II è mostrata qui.
Quantitativamente rispetto al controllo negativo. La percentuale di cellule GFP positive è significativamente più alta e paragonabile a un controllo positivo eseguito con un reagente di trasfezione classico. L'oligopeptide caricato con mRNA ovalbumina e le nanoparticelle di estere poli-beta modificato possono attivare le cellule dendritiche come si vede dall'espressione significativamente più elevata dei marcatori di membrana CD11b e CD86 nelle cellule trasfettate rispetto alle cellule non trasfettate.
La nostra piattaforma di vaccinazione basata sull'uso dell'mRNA come principio attivo, così come i nostri polimeri proprietari, possono essere adattati per essere utilizzati nella profilassi e per le terapie contro il cancro. Possiamo usare la nostra tecnologia per evidenziare quel contributo nell'immunoterapia del cancro. dal momento che possiamo incapsulare antigeni associati al tumore nelle nostre nanoparticelle e fare un cambiamento nei trattamenti contro il cancro.
