Questo protocollo consente la produzione di nanoliposomi sicuri ed efficienti che possono essere utilizzati come veicoli di trasfezione per l'RNA messaggero terapeutico. Questi nanoliposomi facilitano l'assorbimento di mRNA nelle cellule con conseguente aumento dei livelli di espressione proteica senza influire sulla vitalità cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è la generazione rapida e facile di nanoliposomi stabili con dimensioni definite e distribuzione omogenea.
Inoltre, proteggono l'mRNA incapsulato dalla degradazione e portano a una traduzione prolungata. A dimostrare la procedura sarà Antonia Link, dottoranda del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare soluzioni stock per lipidi, colesterolo DC e DOPE sciogliendo ciascuno in cloroformio ad una concentrazione finale di 25 milligrammi per millilitro.
Mescolare 40 microlitri del colesterolo DC disciolto con 80 microlitri della DROGA disciolta in un pallone di vetro. Vaporizzare il cloroformio sotto un flusso di gas argon per 15 minuti. Quindi, riempire un essiccatore con gel di silice.
Posizionare il pallone di vetro aperto all'interno e applicare un vuoto durante la notte per assicurarsi che il cloroformio rimanente sia evaporato. Il film lipidico risultante si formerà all'interno del pallone di vetro. Il giorno dopo, aggiungere un millilitro di acqua priva di nucleasi per reidratare il film lipidico.
E vortice la sospensione per 15 minuti. Posizionare la sospensione in un bagno di sonicazione per un'ora. Successivamente, assemblare il mini estrusore secondo le istruzioni dei produttori.
Riempire una siringa con la sospensione liquida e posizionarla su un lato dell'estrusore. Posizionare una siringa vuota sull'altro lato. Premere la sospensione lipidica attraverso la membrana da una siringa all'altra, circa 20-25 volte per estrudere la sospensione.
Quindi, conservare i nanoliposomi in un pallone di vetro a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. In primo luogo, scongelare l'mRNA sintetico sul ghiaccio. Vortice l'mRNA congelato e poi centrifugarlo poco prima di aprire il tubo.
Quindi, mescolare un microgrammo dell'mRNA sintetico con varie quantità di sospensione nanoliposoma. Centrifugare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per la formazione di nanolipoplex. Quindi, aggiungere millilitro di mezzo cellulare regolare al nanolipoplex e mescolare pipettando su e giù.
Preparare le cellule un giorno prima della trasfezione. Pertanto, placcare 150.000 celle A549 in ogni pozzo di una piastra di 12 po 'un giorno prima della trasfezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e mezzo cellulare regolare per 24 ore.
Quindi il giorno dopo, lavare ogni pozzo di cellule preparate una volta con un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di una miscela di nanolipoplex preparata a uno dei pozzi contenenti le cellule A549. Incubare a condizioni regolari per 24 ore per analizzare l'efficienza di trasfezione o per 24-72 ore per analizzare la vitalità cellulare dopo la trasfezione.
Rimuovere il supernatante e lavare ogni bene con un millilitro di PBS per rimuovere i restanti nanoliposomi. Per preparare le cellule per la citometria, aggiungere prima 500 microlitri di EDTA di tripina ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti per tripinare le cellule. Quindi, aggiungere 500 microlitri di mezzo normale contenente FBS per interrompere il processo e inattivare la tripina.
Centrifugare le cellule a 400 volte G per cinque minuti. E rimuovere con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Lavare le cellule con un millilitro di PBS.
Quindi sospendere di nuovo le celle in 300 microlitri di soluzione di fissaggio cellulare e trasferirle in tubi di citometria a flusso. Usa un citometro a flusso per analizzare le cellule a 488 nanometri. Per preparare le cellule per la microscopia a fluorescenza, aggiungere un millilitro di metanolo refrigerato ad ogni pozzo per fissare le cellule.
Aggiungere 500 microlitri di una soluzione di 300 nanomolare di DAPI disciolta in PBS ad ogni pozzo. Incubare al buio per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione DAPI e lavare nuovamente le celle con metanolo al 100% precedentemente conservato a meno 20 gradi Celsius.
Utilizzare un microscopio a fluorescenza per analizzare le cellule utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione mostrate qui. In questo studio, i nanoliposomi sono generati con un'elevata efficacia di incapsulamento per mRNA modificato sinteticamente. Utilizzando il kit di quantificazione dell'RNA, l'efficacia di incapsulamento dei nanoliposomi può essere analizzata dopo l'incapsulamento di un microgrammo di mRNA codificante eGFP analizzando la quantità libera di mRNA che non è incapsulata.
Dopo l'incapsulamento dell'mRNA EGFP in diverse quantità di nanoliposomi, i nanolipoplex formati possono essere incubati con cellule in vitro e la percentuale di cellule che esprimono eGFP può essere analizzata usando citometria a flusso 24 ore dopo la trasfezione. Come si vede qui, anche solo un microlitro della soluzione di nanoliposomi è sufficiente per ottenere un'elevata trasfezione delle cellule invitro. Quando le cellule vengono trasfette con nanoliposomi contenenti mRNA eGFP etichettato Cy3, è possibile visualizzare la presenza dell'mRNA eGFP nel citoplasma, così come la proteina eGFP già prodotta.
Poiché la trasfezione di cellule che utilizzano nanolipoplex può avere effetti avversi sulle cellule, la vitalità delle cellule è stata testata dopo 24 ore e 72 ore dopo la trasfezione. Non è stato possibile rilevare alcun effetto sulla vitalità cellulare quando le cellule sono state trattate con 2,5 o cinque microlitri di nanolipoplex. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di lavorare continuamente in un ambiente privo di etanolo perché ciò potrebbe danneggiare la stabilità dei nanoliposomi.
Durante la preparazione e la miscelazione del colesterolo DC con DOPE, è necessario utilizzare una pipetta di vetro per evitare la contaminazione dei lipidi disciolti con componenti solubili di punte di pipetta di plastica. Seguendo questo protocollo, i nanoliposomi generati possono essere facilmente manipolati durante o dopo la preparazione. Ad esempio, l'incorporazione di molecole PEG o anticorpi specifici porterebbe a una maggiore stabilità o avvierebbe il targeting attivo dei tessuti.
I nanoliposomi generati soddisfano gli aspetti di sicurezza necessari e facilitano l'assorbimento dell'mRNA nelle cellule bersaglio. I nanoliposomi complessi con uno specifico nRNA terapeutico possono dare un contributo essenziale allo sviluppo di nuove terapie a base di mRNA nel campo dell'ingegneria tissutale o della terapia sostitutiva, ad esempio.
