Questo protocollo propone un metodo semplice per ottenere progenitori ematopoietici umani e per indurre la loro differenziazione in megacariociti. Può servire come base per una migliore comprensione della megacariopoiesi Questa tecnica utilizza una fonte, ma offre il vantaggio di essere conveniente e abbondante per la ricerca di laboratorio nell'ematopoiesi. Questo metodo viene utilizzato per comprendere meglio la megacariopoiesi per la cellula da utilizzare in terapia che dovranno essere preparati nelle condizioni GMP, che attualmente non è il caso.
La comprensione dei passaggi, inclusa la raccolta PBMC, può essere completamente completa solo con una dimostrazione visiva. Prima di iniziare un esperimento, collegare un filtro a leucoriduzione a un sacchetto di trasferimento vuoto da 600 millilitro e a un set di tubi. In un armadio di sicurezza bio iniettare 25 millilitri di tampone di eluizione filtrato per filtro a leucoriduzione nel sacchetto vuoto e utilizzare una siringa da 30 millilitri per aspirare delicatamente il contenuto del sacchetto attraverso il filtro.
Trasferire i globuli rossi raccolti in un nuovo tubo da 50 millilitro e diluire la sospensione cellulare della metà con il 2% di destrano. Mescolare bene per aggregare le cellule del sangue e lasciare che le cellule si sedimentino per 30 minuti a temperatura ambiente. Quando i globuli rossi si sono depositati, trasferire il surnatante in un tubo da 50 millilitri e riempire il tubo con due soluzione pbs EDTA millimolare.
Sovrapporre delicatamente metà del surnatante su 25 millilitri di gradiente di densità medio in ciascuno dei due tubi da 50 millilitri senza disturbare la superficie del gradiente e separare le celle mediante centrifugazione a gradiente di densità. Utilizzare una pipetta monouso per trasferire le celle da ciascuna interfaccia a un nuovo tubo da 50 millilitro. Lavare le celle due volte in 50 millilitri di due PBS EDTA millimolari per lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, risospenare i pellet in un unico volume di 50 millilitro di PBS EDTA fresco per il conteggio. Qui è possibile interrompere la procedura mantenendo le cellule raccolte sotto agitazione a quattro gradi Celsius durante la notte. Per la selezione delle cellule CD34+, determinare il numero di cellule e raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risuscidere il pellet cellulare in 300 microlitri di due PBS EDTA millimolari per 10-ottava cella.
Aggiungere il volume appropriato di reagente che blocca il recettore FC e 50 microlitri di microsfere CD34 per 10 alle ottave cellule. Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le celle con due PBS EDTA millimolari e riconsegnare il pellet in 500 microlitri di PBS EDTA fresco a due millimolari, per 10-otto celle. Umidificare e dimensionare in modo appropriato la colonna magnetica con PBS EDTA, quindi aggiungere il campione alla colonna.
Lavare la colonna due volte con tre millilitri di due PBS EDTA millimolari per lavaggio. Prima di eludere le celle CD34+, con due volumi di cinque millilitri di due PBS EDTA millimolari per eluizione. Per valutare la purezza delle cellule selezionate con perle magnetiche, aggiungere due microlitri di un anticorpo anti CD34 umano appropriato a un'aliquota di 100 microlitri delle cellule isolate e mescolare bene prima di incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule in PBS e ricaspenare il pellet in 200 microlitri di PBS per l'analisi della purezza del campione cellulare mediante citometria a flusso. Dopo il conteggio, raccogliere le celle CD34+ mediante centrifugazione e immediatamente risusciere il pellet in soluzione fredda da uno a una densità di 10 alle sei celle per millilitro prima di aggiungere rapidamente la sospensione cellulare alla soluzione fredda due. Quindi posizionare immediatamente il tubo crio in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 24 ore prima di trasferire il tubo crio in azoto liquido.
In questo studio rappresentativo, le cellule sono state recuperate mediante filtrazione a leucoriduzione, come dimostrato con una vitalità approssimativa del 95%. Dopo la selezione del perla magnetica, è stata ottenuta una popolazione di cellule CD34+ pura superiore al 90%. La proliferazione cellulare in genere diminuisce dopo una settimana di coltura, ma senza cambiamenti significativi nella vitalità cellulare.
Entro il settimo giorno, le cellule CD34 + dovrebbero iniziare a esprimere CD41, un marcatore specifico e precoce o per lo sviluppo di megacariociti e piastrine. Entro il giorno 10, la maggior parte delle cellule della coltura si sviluppa tipicamente in CD41 maturi che esprimono megacariociti. Entro il giorno 13, l'estensione piastrinica dei megacariociti e il rilascio piastrinico possono essere osservati al microscopio ottico.
Il numero totale di CD41, CD42, 8 piastrine positive rilasciate nella coltura può quindi essere quantificato utilizzando un numero calibrato di perle fluorescenti. Questo metodo apre la strada al miglioramento dei meccanismi sottostanti della megacariopoiesi e all'aumento della resa piastrinica in visivo. Anche se questo metodo sembra noioso, è molto semplice devi solo essere paziente e preparare tutte le regioni in anticipo.
Sebbene le nostre preoccupazioni critiche megacariopoiesi otteniamo cellule CD42 possono essere utilizzate in percorsi ematopoietici.
