Gli studi sull'immunizzazione materna e sul trasferimento di anticorpi sono inestimabili per numerose ragioni in quanto questa è la via iniziale di trasferimento dell'immunità e successiva protezione da agenti patogeni e malattie nei neonati e nei neonati. A causa delle somiglianze nella placentation e nel trasferimento di anticorpi con l'uomo, i conigli sono un eccellente modello di immunizzazione materna. In questo articolo video dimostriamo le tecniche che il nostro laboratorio ha utilizzato negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della Nuova Zelanda, tra cui l'immunizzazione intranasale e la raccolta del latte.
Descriveremo prima una sequenza temporale di esempio e una serie di eventi per uno studio di immunizzazione materna mucosa in New Zealand White Rabbits. I conigli femmine vengono immunizzati attraverso la via intranasale, come dimostrato in questo video. A seconda dello studio, il vaccino può richiedere una spinta o potrebbe dover essere somministrato attraverso un percorso aggiuntivo, come l'immunizzazione intramuscolare.
Sebbene non raffigurato, il sangue deve essere raccolto prima dell'immunizzazione iniziale per le misurazioni di base e per tutto il resto dello studio a intervalli regolari. Il sangue è facilmente ostruibile dall'arteria dell'orecchio centrale con una lieve sedazione e un agente analgesico topico. La presenza di livelli IgG specifici dell'antigene può essere misurata in questi campioni.
I conigli vengono quindi allevati. Preferiamo acquistare allevatori comprovati dai venditori da utilizzare per garantire un tasso di gravidanza più elevato per questi studi. A seconda della tempistica di immunizzazione, i conigli possono ricevere immunizzazioni aggiuntive durante la gravidanza.
L'IgG specifico dell'antigene viene trasferito trastontamente ai kit. A circa 30-32 giorni dopo l'allevamento le femmine gravide si adementeranno. Si consiglia di limitare la manipolazione dei kit per i primi giorni per ridurre al minimo il rifiuto da parte delle parti.
I campioni di sangue possono essere raccolti dai kit per valutare i livelli specifici di IgG dell'antigene che sono stati trasferiti traspostamente. Il sangue può essere raccolto da un piccolo numero di kit al momento della nascita o vicino al momento della nascita per valutare i primi livelli di anticorpi specifici dell'antigene. Oltre a un'ampia varietà di nutrienti, i kit ricevono IgA specifico per l'antigene dalla doe in allattamento durante l'allattamento.
I kit sono in genere svezzati a quattro o otto settimane di età. Prima dello svezzamento il latte può essere facilmente raccolto dalla allattamento fa come dimostrato in questo video. I campioni di latte raccolti vengono quindi lavorati per il rilevamento di IgA specifici dell'antigene.
A seconda dello studio, i vaccini e una spinta possono essere somministrati ai kit e i campioni di sangue seriale possono essere raccolti dai kit in tenera età utilizzando la vena safenosa laterale. Ora dimostreremo l'immunizzazione intranasale e la raccolta del latte nei conigli bianchi della Nuova Zelanda.Protocollo. Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con le politiche del Duke University Institutional Animal Care And Use Committee.
Immunizzazione intranasale. Materiali necessari:Acepromazina, siringa e ago, lubrificante oftalmico, Isoflurane, cono del naso, pipetta e punte di pipetta, vaccino mucoso. Preparare la soluzione di immunizzazione prima della manipolazione degli animali.
I conigli vengono sedati con acepromazina un milligrammo per chilogrammo per via intramuscolare e anestetizzati con Isoflurane usando un cono del naso. Una volta completamente anestetizzato come valutato dal riflesso palpebrale, viene aggiunto un lubrificante oftalmico ad ogni occhio per evitare l'essiccazione degli occhi e la successiva ulcerazione corneale. Una volta che il membro del laboratorio è pronto a somministrare il vaccino e il coniglio si trova in un piano adeguato di anestesia, spegnere l'isoflurane e l'ossigeno e rimuovere il cono del naso.
Posizionare il coniglio in rimistranza dorsale e puntellare il collo e la testa con un angolo approssimativo di 45 gradi che consente un facile accesso e visualizzazione di entrambi gli alar da parte del membro del laboratorio che somministra il vaccino. Caricare la pipetta con non più di 100 microlitri della soluzione vaccinale e somministrare rapidamente la soluzione a una narice e ripetere la procedura per la seconda narice. La pipetta deve essere tenuta in un angolo approssimativo di 45 gradi.
Angolo verso l'aspetto mediale del passaggio nasale. L'obiettivo dell'immunizzazione è per la soluzione di contattare le mucose dei nares. Quindi la punta non deve essere posizionata all'interno delle narici in quanto ciò può causare abrasione o irritazione dei tessuti mucosi e potenzialmente influenzare l'immunogenicità del vaccino somministrato nasalmente.
Il vaccino deve essere somministrato rapidamente e fatto allo stesso modo nell'altra narice. Dopo la somministrazione in entrambi i passaggi nasali, il coniglio viene mantenuto in reclinanza dorsale per 30 secondi per ridurre al minimo la perdita della soluzione vaccinale. Il laboratorio in genere somministra non più di 100 microlitri per narice alla volta.
Se si deve somministrare un volume maggiore con un volume totale massimo di 500 microlitri, il vaccino può essere somministrato in 100 aliquote microliter con un periodo di riposo di 30 secondi tra le vaccinazioni. E ulteriori somministrazioni di vaccino ripetute con 30 secondi di riposo tra ogni somministrazione fino a quando non viene consegnato il volume totale del vaccino. Dopo l'immunizzazione, posizionare il coniglio sul ventrum per il recupero e monitorare da vicino l'animale fino a quando non è in grado di mantenere la rimorsipanza sternale.
In alcuni casi, la formulazione del vaccino potrebbe non essere completamente consegnata alla cavità nasale e una parte della formulazione del vaccino può rimanere sulla porzione esterna dei nares. In questo caso, poiché non è chiaro il volume esatto del vaccino che è stato correttamente consegnato alla cavità nasale, non raccomandare la riapplicazione di materiale vaccino aggiuntivo in quanto ciò aggiungerebbe una variabile indefinita all'esperimento. È importante utilizzare una tecnica di somministrazione del vaccino che fornisca una consegna completa e coerente della formulazione del vaccino ai nares.
Raccolta del latte. Materiali necessari:Acepromazina, siringhe e aghi, tampone alcolico, garza, lubrificante oftalmico, Isoflurane, cono nasale, ossitocina e una fiala di raccolta. I conigli vengono sedati con acepromazina un milligrammo per chilogrammo per via intramuscolare e anestetizzati con Isoflurane usando un cono del naso.
Una volta completamente anestetizzato come valutato dal riflesso palpebrale, un lubrificante oftalmico viene applicato su ogni occhio per prevenire l'essiccazione degli occhi e la successiva ulcerazione corneale. Pulire la pelle sulla vena dell'orecchio marginale con il tampone alcolico. Utilizzando una siringa da un mil e un ago calibro 25, somministrare approssimativamente da una a due unità internazionali di ossitocina per via endovenosa dalla vena dell'orecchio marginale per indurre il latte deluso.
A causa del rilassamento muscolare liscio, è comune che il coniglio urina o defechi dopo la somministrazione di ossitocina. Dopo la somministrazione di ossitocina, applicare pressione sul sito di iniezione con un pezzo di garza per fornire emostasi. Pur mantenendo la maschera di anestesia o il cono del naso sul naso del coniglio, puntellare il coniglio sui suoi quarti posteriori.
Come nota a margine, la raccolta del latte può anche essere eseguita con l'animale in reclinamento laterale, ma il laboratorio scopre che la raccolta è più facile quando il coniglio è lungo la sua groppa con un assistente che tiene il coniglio in posizione verticale con la maschera di anestesia. Aprire il tubo sterile per prepararsi alla raccolta del latte e localizzare il tessuto mammario e le te capesine associate. I conigli hanno tipicamente da quattro a cinque paia di ghiandole mammarie.
Le capezzale sono tipicamente circondate da pellicce bagnate di recente allattamento e il tessuto mammario è facilmente palpabile quando pieno di latte. Afferrare il tessuto mammario associato al tato tra il pollice e l'indice e applicare una leggera pressione massaggiante sul tessuto ghiandolare nella direzione del tato. Posizionare il tubo di raccolta sopra il teat per raccogliere il latte espresso.
A volte possono essere necessario diversi minuti prima che l'ossitocina sia efficace e la produzione di latte sembra variare tra le ghiandole mammarie. Se l'espressione del latte non ha successo, attendere alcuni minuti o ruotare verso un'ulteriore ghiandola mammaria. Il latte di tutte le te capesante può essere raccolto nello stesso vile.
Tipicamente diversi millilitri di latte possono essere facilmente raccolti da una doe in allattamento. Dopo aver raccolto il volume desiderato di latte, spegnere l'isoflurane e l'ossigeno e rimuovere il cono del naso dal coniglio e consentire al coniglio di riprendersi mentre è attentamente monitorato fino a quando l'animale non è in grado di mantenere la reclinanza sternale. Risultati rappresentativi.
Figura uno. Per gli studi materni, determinare la gravidanza il prima possibile è utile per confermare che la coniglia non ha bisogno di essere rinascita. Le opzioni per il rilevamento della gravidanza includono palpazione, ultrasuoni, radiografie, aumento di peso e tecniche molecolari come misurazioni dei fattori di crescita dell'insulina e del progesterone.
Adeguati livelli di progesterone sono necessari per il mantenimento della gravidanza nei conigli. Pertanto diversi studi hanno anche valutato i livelli di progesterone nei conigli in gravidanza e hanno dimostrato livelli elevati rispetto ai conigli non gravidi, in particolare durante l'organogenesi intorno alla gestazione media. Come mostrato nella prima figura, alti livelli di progesterone possono essere rilevati nei conigli in gravidanza rispetto ai conigli non gravidi anche dopo che gli accoppiamenti di un dollaro sono stati confermati per tutti.
I livelli di progesterone sierica sono stati misurati utilizzando un saggio chemiluminescente automatizzato. Figura due. L'IgG specifico dell'antigene che è stato trasferito trasplacentalmente durante la gestazione può essere misurato nel siero dei kit da Elisa.
Il sangue può essere raccolto da un piccolo numero di kit al momento della nascita o vicino al momento della nascita per valutare i primi livelli di anticorpi specifici dell'antigene. La raccolta del sangue seriale è tecnicamente molto più semplice con l'età dei kit e l'aumento delle dimensioni. Come illustrato nella figura due, i livelli sieri di IgG specifico dell'antigene nei kit possono essere misurati e confrontati con i livelli materni.
I livelli di IgG trasferiti maternamente sono più alti alla nascita e diminuiscono nel tempo. Figura tre. Il latte di coniglio può essere raccolto come mostrato in questo video e lavorato per misurare i livelli di anticorpi totali e specifici dell'antigene di Elisa.
Come mostrato in questa figura, IgA costituisce una parte significativa degli anticorpi totali all'interno del latte materno disponibili per il trasferimento passivo ai kit. Sia i livelli IgA che IgG sono notevolmente superiori a IgM.Summary. Questo video articolo descrive e dimostra la somministrazione di vaccini intranasali e la raccolta di latte dai conigli in allattamento come mezzo per valutare l'immunità mucosa in un modello traslazionemente appropriato di immunizzazione materna.
Raffigurata è un'immagine sintetica per un tipico studio di immunizzazione intranasale materna che incorpora le immunizzazioni, l'allevamento, l'adessimento, l'allattamento e il trasferimento di anticorpi.
