Studien zur mütterlichen Immunisierung und zum Antikörpertransfer sind aus zahlreichen Gründen von unschätzbarem Wert, da dies der erste Weg des Immunitätstransfers und des anschließenden Schutzes vor Krankheitserregern und Krankheiten bei Neugeborenen und Säuglingen ist. Aufgrund von Ähnlichkeiten in der Plazentation und dem Antikörpertransfer mit dem Menschen sind Kaninchen ein hervorragendes Modell für die mütterliche Immunisierung. In diesem Videoartikel demonstrieren wir Techniken, die unser Labor in Studien zur mütterlichen Immunisierung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen eingesetzt hat, einschließlich intranataner Immunisierung und Milchsammlung.
Wir werden zunächst einen Beispielzeitplan und eine Reihe von Ereignissen für eine Schleimhaut-Mütter-Immunisierungsstudie bei neuseeländischen White Rabbits beschreiben. Weibliche Kaninchen werden über den intranasalen Weg immunisiert, wie in diesem Video gezeigt. Abhängig von der Studie kann der Impfstoff einen Schub erfordern oder muss möglicherweise über einen zusätzlichen Weg verabreicht werden, z. B. durch intramuskuläre Immunisierung.
Obwohl nicht dargestellt, sollte Blut vor der ersten Immunisierung für Baseline-Messungen und während des restlichen Verlaufs der Studie in regelmäßigen Abständen entnommen werden. Blut wird leicht von der zentralen Ohrarterie mit leichter Sedierung und einem topischen Analgetikum gewonnen. Das Vorhandensein von antigenspezifischen IgG-Spiegeln kann in diesen Proben gemessen werden.
Kaninchen werden dann gezüchtet. Wir ziehen es vor, bewährte Züchter von Anbietern zu kaufen, um eine höhere Schwangerschaftsrate für diese Studien zu gewährleisten. Abhängig vom Impfzeitplan können Kaninchen während der Schwangerschaft zusätzliche Impfungen erhalten.
Antigenspezifisches IgG wird transplazent auf die Kits übertragen. Nach etwa 30 bis 32 Tagen nach der Zucht wird schwanger werden. Wir empfehlen, die Handhabung der Kits für die ersten Tage zu begrenzen, um die Ablehnung durch die Does zu minimieren.
Blutproben können aus den Kits entnommen werden, um antigenspezifische IgG-Spiegel zu beurteilen, die transplazent übertragen wurden. Blut kann aus einer kleinen Anzahl von Kits zum oder in der Nähe der Geburt entnommen werden, um frühe antigenspezifische Antikörperspiegel zu beurteilen. Zusätzlich zu einer Vielzahl von Nährstoffen erhalten Kits antigenspezifisches IgA vom stillenden Doe während der Stillzeit.
Kits werden in der Regel im Alter von vier bis acht Wochen entsönet. Vor dem Absetzen kann Milch leicht aus laktierenden Nähren gesammelt werden, wie in diesem Video gezeigt. Die gesammelten Milchproben werden dann für den Nachweis von antigenspezifischem IgA aufbereitet.
Je nach Studie können Impfstoffe und ein Boost an die Kits verabreicht werden und Serienblutproben können in einem sehr frühen Alter mit der lateralen Vena saphena entnommen werden. Wir werden nun die intranasale Immunisierung und Milchsammlung in Neuseeland White Rabbits demonstrieren.Protokoll. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Duke University Institutional Animal Care And Use Committee genehmigt und durchgeführt.
Intranasale Immunisierung. Benötigte Materialien: Acepromazin, Spritze und Nadel, Augengleitmittel, Isofluran, Nasenkegel, Pipette und Pipettenspitzen, Schleimhautimpfstoff. Bereiten Sie die Impflösung vor dem Umgang mit dem Tier vor.
Kaninchen werden mit Acepromazin ein Milligramm pro Kilogramm intramuskulär sediert und mit Isofluran mit einem Nasenkegel betäubt. Nach der vollständigen Betäubung, wie durch den Augenlidreflex beurteilt, wird jedem Auge ein ophthalmisches Gleitmittel hinzugefügt, um das Austrocknen der Augen und nachfolgende Hornhautgeschwüre zu verhindern. Sobald das Labormitglied bereit ist, den Impfstoff zu verabreichen und sich das Kaninchen in einer angemessenen Anästhesieebene befindet, schalten Sie das Isofluran und den Sauerstoff aus und entfernen Sie den Nasenkegel.
Legen Sie das Kaninchen in die dorsale Liege und stützen Sie Hals und Kopf in einem Winkel von etwa 45 Grad, der einen einfachen Zugang und die Visualisierung beider Alaren durch das Labormitglied ermöglicht, das den Impfstoff verabreicht. Laden Sie die Pipette mit nicht mehr als 100 Mikrolitern der Impfstofflösung und verabreichen Sie die Lösung schnell an ein Nasenloch und wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Nasenloch. Die Pipette sollte in einem Winkel von ca. 45 Grad gehalten werden.
Winkel zum medialen Aspekt des Nasengangs. Das Ziel der Immunisierung ist es, dass die Lösung die Schleimhautmembranen der Nares berührt. Daher sollte die Spitze nicht innerhalb der Nares platziert werden, da dies zu Abrieb oder Reizung des Schleimhautgewebes führen und möglicherweise die Immunogenität des nasal verabreichten Impfstoffs beeinflussen kann.
Der Impfstoff sollte schnell verabreicht und auf die gleiche Weise im anderen Nasenloch verabreicht werden. Nach der Verabreichung in beiden Nasengängen wird das Kaninchen 30 Sekunden lang in dorsaler Liege gehalten, um das Austreten der Impfstofflösung zu minimieren. Das Labor verabreicht in der Regel nicht mehr als 100 Mikroliter pro Nasenloch gleichzeitig.
Soll ein größeres Volumen mit einem maximalen Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern verabreicht werden, kann der Impfstoff in 100 Mikroliter Aliquoten mit einer 30-sekündigen Ruhezeit zwischen den Impfungen verabreicht werden. Und zusätzliche Verabreichungen von Impfstoff wiederholt mit 30 Sekunden Ruhe zwischen jeder Verabreichung, bis das gesamte Impfstoffvolumen geliefert ist. Legen Sie das Kaninchen nach der Immunisierung zur Genesung auf das Ventrum und überwachen Sie das Tier genau, bis es in der Lage ist, die sternale Liege zu erhalten.
In einigen Fällen kann die Impfstoffformulierung nicht vollständig an die Nasenhöhle abgegeben werden, und ein Teil der Impfstoffformulierung kann auf dem äußeren Teil der Nares verbleiben. Da in diesem Fall nicht klar ist, wie viel genau der Impfstoff in die Nasenhöhle abgegeben wurde, empfehlen Sie nicht, zusätzliches Impfstoffmaterial erneut aufzuträgen, da dies dem Experiment eine undefinierte Variable hinzufügen würde. Es ist wichtig, eine Impfstoffverabreichungstechnik zu verwenden, die eine vollständige und konsistente Abgabe der Impfstoffformulierung an die Nares ermöglicht.
Milchsammlung. Benötigte Materialien: Acepromazin, Spritzen und Nadeln, Alkoholtupfer, Gaze, ophthalmisches Gleitmittel, Isofluran, Nasenkegel, Oxytocin und eine Sammelfläschchen. Kaninchen werden mit Acepromazin ein Milligramm pro Kilogramm intramuskulär sediert und mit Isofluran mit einem Nasenkegel betäubt.
Nach der vollständigen Betäubung, wie durch den Augenlidreflex beurteilt, wird auf jedes Auge ein ophthalmisches Gleitmittel aufgetragen, um das Austrocknen der Augen und nachfolgende Hornhautgeschwüre zu verhindern. Reinigen Sie die Haut über der randalen Ohrvene mit dem Alkoholtupfer. Verabreichen Sie mit einer Spritze von einem Mil und einer 25-Gauge-Nadel etwa ein bis zwei internationale Einheiten Oxytocin intravenös über die marginale Ohrvene, um milchablassend zu induzieren.
Aufgrund der Entspannung der glatten Muskulatur ist es üblich, dass das Kaninchen nach der Verabreichung von Oxytocin uriniert oder defäkiert. Nach der Verabreichung von Oxytocin mit einem Stück Gaze Druck auf die Injektionsstelle ausüben, um eine Hämostase zu erhalten. Während Sie die Anästhesiemaske oder den Nasenkegel über der Nase des Kaninchens halten, stützen Sie das Kaninchen auf seinen Hintervierteln.
Als Randnotiz kann die Milchsammlung auch mit dem Tier in seitlicher Liege durchgeführt werden, aber das Labor stellt fest, dass die Sammlung einfacher ist, wenn das Kaninchen auf seinem Hintern gestützt wird, wobei ein Assistent das Kaninchen mit der Anästhesiemaske aufrecht hält. Öffnen Sie das sterile Röhrchen, um sich auf die Milchsammlung vorzubereiten, und lokalisieren Sie das Brustgewebe und die zugehörigen Zitzen. Kaninchen haben typischerweise vier bis fünf Paar Brustdrüsen.
Die Zitzen sind typischerweise von nassem Fell aus der jüngsten Stillzeit umgeben und das Brustgewebe ist leicht tastbar, wenn es mit Milch gefüllt ist. Greifen Sie nach dem Brustgewebe, das mit der Zitze zwischen Daumen und Zeigefinger verbunden ist, und drücken Sie einen sanften Massagedruck auf das Drüsengewebe in Richtung der Zitze aus. Legen Sie das Auffangrohr über die Zitze, um die abgepumpte Milch zu sammeln.
Es kann manchmal mehrere Minuten dauern, bis das Oxytocin wirksam ist, und die Milchproduktion scheint zwischen den Brustdrüsen zu variieren. Wenn die Milchexpression nicht erfolgreich ist, warten Sie einige Minuten oder drehen Sie sich zu einer zusätzlichen Brustdrüse. Milch aus allen Zitzen kann im selben Vile gesammelt werden.
Typischerweise können mehrere Milliliter Milch leicht von einem stillenden Doe gesammelt werden. Nachdem das gewünschte Milchvolumen gesammelt wurde, schalten Sie das Isofluran und den Sauerstoff aus und entfernen Sie den Nasenkegel vom Kaninchen und lassen Sie das Kaninchen sich erholen, während es genau überwacht wird, bis das Tier in der Lage ist, die sternale Liege zu erhalten. Repräsentative Ergebnisse.
Abbildung eins. Für mütterliche Studien ist die Frühbestimmung der Schwangerschaft hilfreich, um zu bestätigen, dass das Resi nicht neu gezüchtet werden muss. Optionen für die Schwangerschaftserkennung umfassen Palpation, Ultraschall, Röntgenaufnahmen, Gewichtszunahme und molekulare Techniken wie Messungen von Insulinwachstumsfaktoren und Progesteron.
Ausreichende Progesteronspiegel sind für die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit bei Kaninchen notwendig. Daher haben mehrere Studien auch den Progesteronspiegel bei trächtigen Kaninchen untersucht und erhöhte Werte im Vergleich zu nicht trächtigen Kaninchen gezeigt, insbesondere während der Organogenese um die Mitte der Schwangerschaft. Wie in Abbildung eins gezeigt, können erhöhte Progesteronspiegel bei trächtigen Kaninchen im Vergleich zu nicht trächtigen Kaninchen nachgewiesen werden, selbst nachdem die Paarung durch einen Bock für alle Bestände bestätigt wurde.
Der Serumprogesteronspiegel wurde mit einem automatisierten Chemilumineszenz-Assay gemessen. Abbildung zwei. Antigenspezifisches IgG, das während der Schwangerschaft transplazentarisch übertragen wurde, kann im Serum der Kits von Elisa gemessen werden.
Blut kann aus einer kleinen Anzahl von Kits zum oder in der Nähe der Geburt entnommen werden, um frühe antigenspezifische Antikörperspiegel zu beurteilen. Die serielle Blutentnahme ist technisch viel einfacher, da die Kits altern und an Größe zunehmen. Wie in Abbildung zwei dargestellt, können die Serumspiegel von antigenspezifischem IgG in den Kits gemessen und mit den mütterlichen Spiegeln verglichen werden.
Die mütterlich übertragenen IgG-Spiegel sind bei der Geburt höher und nehmen im Laufe der Zeit ab. Abbildung Drei. Kaninchenmilch kann wie in diesem Video gezeigt gesammelt und verarbeitet werden, um die Gesamt- und Antigen-spezifischen Antikörperspiegel von Elisa zu messen.
Wie in dieser Abbildung gezeigt, macht IgA einen signifikanten Teil der gesamten Antikörper in der Muttermilch aus, die für den passiven Transfer in die Kits zur Verfügung stehen. Sowohl der IgA- als auch der IgG-Spiegel sind deutlich höher als der IgM.Summary. Dieser Videoartikel beschreibt und demonstriert die Verabreichung von intranasalen Impfstoffen und die Sammlung von Milch von stillenden Kaninchen als Mittel zur Beurteilung der Schleimhautimmunität in einem translational geeigneten Modell der mütterlichen Immunisierung.
Abgebildet ist ein zusammenfassendes Bild für ein typisches mütterliches intranataler Immunisierungsstudiendesign, das die Immunisierungen, Züchtung, Anzündung, Laktation und Antikörpertransfer umfasst.
