Questo flusso di lavoro di dissezione e analisi a tutto monte fornisce un nuovo approccio per analizzare la morfologia completa dei singoli pergolati nervosi del gusto, trasducendo i numeri di tipo cellulare e le relazioni fisiche tra le cellule. La raccolta dell'intero epitelio linguale ci consente di misurare il numero assoluto di cellule e il volume di innervazione all'interno dell'intera pappa gustativa. Questo approccio è più accurato delle stime della struttura cellulare basate sul campionamento da sezioni, il che riduce la variabilità tecnica.
Questo è anche il primo metodo che fornisce un'analisi dettagliata delle cellule delle papille gustative in relazione alla loro innervazione. Questo metodo può migliorare le indagini sui potenziali circuiti all'interno della papilla gustativa, nonché i processi patologici e le chemioterapie che interrompono la normale funzione del gusto. Nella maggior parte di questi casi, non è chiaro quale struttura o relazione sia interrotta, quindi mantenere intatti tutti questi fattori consente tutte le analisi all'interno di una singola preparazione.
L'errore più comune è cercare di evitare di danneggiare l'epitelio non sezionando abbastanza vicino alla parte inferiore dell'epitelio. È imperativo rimuovere il più possibile il tessuto sottostante prima di congelare il tessuto nella muffa del tessuto. È anche importante assicurarsi che l'epitelio sia piatto sul fondo dello stampo del tessuto.
Iniziare scongelando e risciacquando la lingua in 0,1 tampone di fosfato molare. Quindi posizionare 1/2 della lingua anteriore contenente le papille fungiformi su un vetrino sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare pinze smussate e forbici di dissezione per rimuovere il muscolo e tenere il tessuto aperto mentre l'epitelio linguale è curvo, garantendo un orientamento piatto del tessuto mantenendo le lame delle forbici da dissezione grossolana parallele all'epitelio.
Scartare l'epitelio ventrale non cheratinizzato della lingua in quanto non contiene papille gustative. Quindi utilizzare forbici di dissezione fine per una dissezione più vicina alla parte inferiore dell'epitelio cheratinizzato. Utilizzare una pinza smussata per posare un pezzo di epitelio in uno stampo di tessuto e assicurarsi che sia piatto.
Quindi aggiungere una goccia di composto ottimale per la temperatura di taglio, o OCT, al tessuto. Posizionare lo stampo del tessuto su una base metallica precedentemente raffreddata sotto l'ambito di dissezione, quindi continuare a picchiettare leggermente il tessuto con la pinza fino a quando l'OCT non si è congelato, assicurandosi che il tessuto si congeli il più piatto possibile. Una volta che l'OCT si è congelato, aggiungere rapidamente un ulteriore OCT e posizionare lo stampo in un becher di 2-metilbutano raffreddato fino a quando non è congelato.
Montare lo stampo OCT sul criostato e tagliarlo in sezioni da 20 micron. Raccogli ogni sezione e visualizzala al microscopio ottico per valutarne la vicinanza alla base dell'epitelio. Dopo che il tessuto è stato rasato dalla parte inferiore dell'epitelio, scongelare l'epitelio e risciacquarlo due volte in 0,1 PB molare su uno shaker.
Tagliare il palato duro anteriormente alla giunzione del palato molle e duro, quindi separare il palato molle dal tessuto sottostante, assicurandosi che eventuali frammenti ossei rimanenti vengano tagliati e rimuovendo ulteriori muscoli e tessuto connettivo. Tenere il palato con una pinza smussata e rimuovere le ghiandole rimanenti e perdere il tessuto connettivo raschiandole delicatamente con una lama di rasoio. Le papille gustative intere e tutte le innervazioni delle papille gustative nei topi Phox2b-Cre TdTomato sono state etichettate colorando l'epitelio linguale con anticorpi per DsRed e cheratina otto.
Il volume delle papille gustative è stato misurato e non ha rivelato correlazioni tra i volumi delle papille gustative e i volumi di innervazione nelle regioni di misurazione fungiformi o circumvallate. La somministrazione di una bassa dose di tamoxifene nei topi TrkB CreER TdTomato provoca la ricombinazione genica e l'etichettatura di un piccolo numero di neuroni. Qui viene mostrata una papilla gustativa a tutto monte macchiata con marcatori cellulari trasduttori del gusto anidrasi carbonica quattro e fosfolipasi C beta due.
Questa papilla gustativa ha due pergole terminali etichettate, che vengono mostrate con la papilla gustativa rimossa dopo aver ricostruito le fibre. L'utilizzo di un software di imaging basato su pixel cellulari per determinare la vicinanza più stretta tra le fibre nervose e le cellule trasduttori del gusto ha rivelato che su 19 cellule trasduttori del gusto, il pergolato terminale blu si trovava entro 200 nanometri dall'anidrasi carbonica azzurra quattro più cellula. Il pergolato terminale associato al tracciato verde è mostrato in magenta e si trova entro 200 nanometri sia dall'anidrasi carbonica azzurra che blu scuro quattro più cellule.
La colorazione a cheratina intera otto e 5-etinil-2'deossiuridina o EdU delle papille gustative fungiformi ha rivelato che le cellule etichettate edU erano presenti sia all'interno che all'esterno delle papille gustative. I nuclei magenta e viola sono osservati al di fuori della cheratina otto più il bordo della papilla gustativa. Le cellule gialle, verde acqua e blu erano all'interno della papilla gustativa.
Quando si tenta questo protocollo, le fasi di dissezione e congelamento dei tessuti sono fondamentali. Questi metodi di dissezione dei tessuti possono essere seguiti dalla colorazione per una varietà di cellule e strutture per analizzare le relazioni sia all'interno della papilla gustativa che al di fuori della papilla gustativa, ma all'interno della papilla. Questa è la prima analisi dei pergolati di gusto interi all'interno della papilla gustativa, così come le loro relazioni con le cellule trasduttori del gusto.
La conservazione e la colorazione di molti di questi elementi in un'unica preparazione amplia le possibilità di analisi e perfeziona le misurazioni possibili.
