Il protocollo combina il potere di generare tipi di cellule cardiovascolari umane utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte e una tecnica versatile per generare sferoidi cardiaci battenti in meno di 72 ore. Questi sferoidi cardiaci possono essere utilizzati per la modellazione della malattia e test antidroga. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica facile è che si potrebbero generare quasi 1000 sferoidi cardiaci battenti in una piastra standard a 12 pozzetti.
E, soprattutto, ogni sferoide cardiaco può essere testato per la sua funzione contrattile utilizzando la tecnica basata sull'imaging. Dopo aver sciolto l'agarosio nel microonde, metterlo nell'armadio di biosicurezza e lasciarlo raffreddare per tre minuti. Pipettare 700 microlitri dell'agarosio fuso e aggiungerlo al microstampo siliconico di un array nove per nove, avendo cura di evitare di generare bolle.
Posizionare con attenzione lo stampo sul blocco di ghiaccio pre-freddo per accelerare la durata dell'agarosio. Una volta che l'agarosio diventa traslucido, piegare con attenzione i bordi del microstampo per losen la replica di agarosio e staccare delicatamente la replica da tutti i lati per staccarla dal microstampo di silicone. Trasferire il vassoio di microtessuta di agarosio contenente 81 recessi circolari in una piastra sterile a 12 pozzetti, quindi aggiungere due millilitri di PBS al vassoio di microtessuta di agarosio e ispezionarlo al microscopio per eventuali bolle intrappolate o pozzi di forma irregolare.
Immergere il vassoio di agarosio in due millilitri di etanolo al 70% durante la notte, seguito dal trattamento UV nell'armadio di biosicurezza per un'ora. Rimuovere il 70% di etanolo e lavare due volte con acqua distillata e una volta con due millilitri di PBS. Una volta che i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, i fibroblasti cardiaci e le cellule endoteliali vengono contati dopo la tripsinizzazione e la neutralizzazione, posizionare le sospensioni cellulari sul ghiaccio.
In un nuovo tubo, mescolare i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, i fibroblasti cardiaci e le cellule endoteliali. Quindi, rimuovere il PBS dal pozzo e dalla camera di semina cellulare senza toccare i recessi e aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare a goccia. Lasciare che le cellule si depositino a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per due ore.
Aggiungere il mezzo di fabbricazione di micro tessuto che circonda lo stampo di agarosio per coprire la superficie della camera interna. Dopo 24 ore, osservare per sferoidi autoassemblati e compatti nei recessi circolari. Cambiare il mezzo ogni due giorni per mantenere gli sferoidi.
Tipicamente, dopo 48 ore, si può osservare un battito spontaneo degli sferoidi. Coltivare i singoli tipi di cellule separatamente su un mezzo a matrice di membrana basale o vetrini a camera rivestiti di gelatina. Lavare delicatamente i microtessuti cardiaci dai recessi circolari e raccoglierli in un tubo di cronaca da 15 millilitri.
Aspirare il mezzo e risciacquare le cellule o i microtessuti, con un millilitro di PBS. Quindi, fissare le cellule o i microtessuti con tampone di fissazione contenente il 4,2% di PFA e incubare a temperatura ambiente. Aspirare il PFA e incubare le cellule o i microtessuti con un millilitro di soluzione permeabilizzante.
Quindi, aspirare la soluzione e risciacquare con due o tre millilitri di PBS. Aggiungere da 500 a 1000 microlitri di soluzione bloccante alle cellule e incubare per almeno un'ora per i vetrini della camera e per tre o quattro ore per i microtessuti. Incubare i campioni con anticorpi coniugati nella soluzione bloccante per un'ora per i vetrini della camera e durante la notte a quattro gradi Celsius per i microtessuti cardiaci.
Lavare le diapositive della camera tre volte con 500 microlitri dello 0,1% Tween 20, con una durata di cinque minuti tra ogni lavaggio, quindi eseguire un lavaggio finale con PBS. Lavare i micro tessuti cardiaci cinque volte con due millilitri dello 0,1% Tween 20, con una durata di 20 minuti tra ogni lavaggio. Quindi, eseguire un lavaggio finale per altri 20 minuti.
Incubare le cellule o i microtessuti con DAPI prima della microscopia confocale, quindi trasferire con cura i microtessuti cardiaci su un piatto di fondo di vetro da 35 millimetri e aggiungere PBS per immergere il microtessuto. Sciacquare i microtessuti dai recessi circolari con uno medio usando una punta di pipetta larga o di un millilitro in un tubo cronico da 15 millilitri e lasciarli depositare. Quindi, aspirare il mezzo e risciacquare con un millilitro PBS.
Aggiungere da 200 a 300 microlitri del tampone di digestione enzimatica e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi mescolare delicatamente i microtessuti per un minuto e ripetere l'incubazione. Dopo l'incubazione, mescolare vigorosamente i microtessuti con una punta di pipetta normale da un millilitro per digerirlo in singole cellule.
Ottenere una sospensione a cellule torbide e neutralizzare immediatamente la sospensione cellulare con cinque millilitri di mezzo contenenti il 5% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri e contare il numero totale di cellule. Centrifugare la sospensione monocellulare a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e risospesare le cellule nel tampone legante l'annessina con FITC Annexin V e ioduro di propidio, o colorante di esclusione delle cellule morte TO-PRO-3, e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, aggiungere 300 microlitri del tampone legante l'annessina alla sospensione cellulare e trasferirla in un tubo FACS a fondo tondo per l'analisi della citometria a flusso. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte purificate, cellule endoteliali e fibroblasti cardiaci sono stati visualizzati utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
La purezza di diversi tipi di cellule è stata determinata utilizzando la colorazione immuno e la citometria a flusso. La troponina T è stata utilizzata come marcatore per i cardiomiociti ed è stata raggiunta una purezza superiore al 90%. La molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche CD31 e la vimentina sono state utilizzate come marcatori per le cellule endoteliali e i fibroblasti cardiaci e hanno indicato una purezza superiore rispettivamente al 98 e al 96%.
La colorazione di immunofluorescenza ha rivelato che i cardiomiociti erano i più pesanti e occupavano il centro dei microtessuti, mentre le cellule endoteliali erano intervallate in tutti i microsucchi e i fibroblasti cardiaci occupavano prevalentemente la periferia. La digestione dei microtessuti utilizzando questo ritmo uno e Liberase TL ha portato a proporzioni cellulari altamente vitali con meno cellule apoptotiche dopo due settimane in coltura. L'esposizione di un'ora dei microtessuti cardiaci ad un'alta concentrazione di doxorubicina ha indotto cardiotossicità dose-dipendente.
La contrattilità dei micro tessuti e il movimento dei vettori hanno generato una pseudo mappa termica che ha illustrato il profilo di contrazione media attraverso il microtessuto. Il moto contrattile dei microtessuti cardiaci ha generato picchi positivi che sono stati misurati come la velocità di contrazione, la velocità di rilassamento e la frequenza di battito, che è stata calcolata come tempo tra due cicli di contrazione. La contrattilità dei microtessuti cardiaci è stata costante per quattro settimane in coltura.
Il riscaldamento delle celle è uno dei passaggi più importanti in questo particolare protocollo, in cui si deve fare attenzione a erogare con cura la sospensione cellulare dropwise nell'array di agarosio per una distribuzione uniforme all'interno dei micro pozzetti e per prevenire il trabocco. Utilizzando il protocollo di radiazione ottimizzato di questi microtessuti, si potrebbe sottoporli a tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, come RNA-seq a singola cellula o ATAC-seq a cellula singola per comprendere i modelli di espressione genica specifici della cellula risultanti a causa di diverse condizioni di trattamento.
