使用人iPSC衍生的心肌细胞，心脏成纤维细胞和内皮细胞制造3D心脏微组织阵列

该协议结合了使用诱导多能干细胞产生人类心血管细胞类型的能力，以及一种多功能技术，可在不到72小时内产生跳动的心脏球状体。这些心球体可用于疾病建模和药物测试。这种简单技术的主要优点之一是，可以在标准的12孔板中产生近1000个跳动的心脏球体。

最重要的是，每个心脏球体都可以使用基于成像的技术来检测其收缩功能。在微波炉中融化琼脂糖后，将其放入生物安全柜中，让它冷却三分钟。移取700微升熔融琼脂糖，并将其添加到9×9阵列的有机硅微模中，注意避免产生气泡。

小心地将模具放在预冷的冰块上，以加速琼脂糖的持续时间。一旦琼脂糖变为半透明，小心地弯曲微模的边缘以失去琼脂糖复制品，并从各个侧面轻轻剥离复制品，将其从硅胶微模中分离出来。将含有81个圆形凹槽的琼脂糖微量组织托盘转移到无菌的12孔板中，然后将两毫升PBS加入琼脂糖微量组织托盘中，并在显微镜下检查是否有任何捕获的气泡或不规则形状的孔。

将琼脂糖托盘浸没在两毫升70%乙醇中过夜，然后在生物安全柜中进行紫外线处理一小时。除去70%乙醇，用蒸馏水洗涤两次，一次用两毫升PBS洗涤。一旦在胰蛋白酶消化和中和后计数诱导多能干细胞衍生的心肌细胞，心脏成纤维细胞和内皮细胞，将细胞悬浮液放在冰上。

在新管中，混合诱导多能干细胞衍生的心肌细胞，心脏成纤维细胞和内皮细胞。然后，从孔和细胞接种室中取出PBS而不接触凹槽，并滴加200微升细胞悬浮液。让细胞在37摄氏度下在二氧化碳培养箱中沉降两个小时。

在琼脂糖模具周围加入微组织制造介质以覆盖内腔表面。24小时后，观察圆形凹槽中的自组装和紧凑型球体。每两天更换培养基以保持球体。

通常，48小时后，可以观察到球体的自发跳动。在基底膜基质培养基或明胶包被的腔室载玻片上分别培养各个细胞类型。轻轻地将心脏微量组织从圆形凹槽中冲洗出来，并将它们收集在15毫升的编年史管中。

吸出培养基并用一毫升PBS冲洗细胞或微组织。然后，用含有4.2%PFA的固定缓冲液固定细胞或微组织，并在室温下孵育。吸出PFA并用一毫升渗透溶液孵育细胞或微组织。

然后，吸出溶液并用两到三毫升PBS冲洗。向细胞中加入500至1000微升的封闭溶液，并孵育至少一小时用于腔室载玻片，三到四个小时用于微组织。将含有偶联抗体的样品在封闭溶液中孵育一小时用于腔室载玻片，并在4摄氏度下过夜用于心脏微组织。

用500微升0.1%吐温20洗涤腔室载玻片三次，每次洗涤间隔五分钟，然后用PBS进行最终洗涤。用两毫升0.1%吐温20洗涤心脏微组织五次，每次洗涤间隔20分钟。然后，再进行20分钟的最终洗涤。

在共聚焦显微镜检查之前，用DAPI孵育细胞或微组织，然后小心地将心脏微组织转移到35毫米玻璃底培养皿中，并加入PBS以浸没微组织。使用宽或一毫升移液器吸头将微组织从圆形凹槽中冲洗出来，使其沉淀15毫升，并使其沉降。然后，吸出培养基并用一毫升PBS冲洗。

加入200至300微升酶消化缓冲液，并在37摄氏度下孵育10分钟。然后轻轻混合微量组织一分钟，并重复孵育。孵育后，用常规的一毫升移液器吸头大力混合微量组织，将其消化成单细胞。

获得浑浊的细胞悬浮液，并立即用含有5%FBS的5毫升培养基中和细胞悬浮液。通过40微米细胞过滤器过滤细胞悬浮液，并计数细胞总数。将单细胞悬浮液以300倍G在4摄氏度下离心五分钟。

吸出上清液并将细胞与FITC膜联蛋白V和碘化丙啶或TO-PRO-3死细胞排除染料重悬于膜联蛋白结合缓冲液中，并在冰上孵育10分钟。孵育后，向细胞悬浮液中加入300微升膜联蛋白结合缓冲液，并将其转移到圆底FACS管中进行流式细胞术分析。使用相差显微镜观察纯化的诱导多能干细胞衍生的心肌细胞，内皮细胞和心脏成纤维细胞。

使用免疫染色和流式细胞术测定不同细胞类型的纯度。肌钙蛋白T作为心肌细胞的标志物，纯度超过90%。将血小板内皮细胞粘附分子CD31和vimentin作为内皮细胞和心脏成纤维细胞的标志物，纯度分别超过98%和96%。

免疫荧光染色显示，心肌细胞最重，占据微组织中心，而内皮细胞散布在整个微组织中，心脏成纤维细胞主要占据外围。使用这种速度一和Liberase TL对微组织进行消化，在培养两周后产生了高度活的细胞比例和更少的凋亡细胞。心脏微量组织暴露于高浓度阿霉素诱导剂量依赖性心脏毒性的一小时。

微组织收缩力和载体运动产生了伪热图，说明了整个微组织的平均收缩曲线。心脏微组织的收缩运动产生正峰，其测量为收缩速度，松弛速度和节拍率，其计算为两个收缩周期之间的时间。在培养物中，心脏微组织的收缩性在四周内保持一致。

细胞加热是该特定方案中最重要的步骤之一，其中必须注意小心地将细胞悬浮液滴入琼脂糖阵列中，以便在微孔内均匀分布，并防止溢出。使用这些微量组织的优化辐射方案，人们可以将其置于高通量测序技术中，例如单细胞RNA-seq或单细胞ATAC-seq，以了解由于不同的处理条件而产生的细胞特异性基因表达模式。