Name: differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Vorremmo ringraziare il Dr. Ryan Hobbs per l'assistenza nel sezionamento. Ringraziamo le strutture principali del Penn State College of Medicine, tra cui le scienze del genoma e la bioinformatica, l'Advanced Light Microscopy Imaging e la citometria a flusso. Ringraziamo anche il Dr. Yuka Imamura per l'assistenza nell'analisi RNA-seq.

1. Cultura mESC
<ol><li>Rivestire una piastra di 10 cm trattata con coltura tissutale con lo 0,1% di gelatina e lasciare riposare la gelatina per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.</li>
	<li>I fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati γ un giorno prima di coltivare le mESC nel mezzo mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 15% fetale bovine serum (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Consentire ai MEF irradiati γ di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.</li>
	<li>Scongelare gli ESC E14 a bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le celle in un tubo conico di 15 cm con mezzo caldo mESC. Pellet le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospese le cellule in 10 mL di terreno mESC e placcare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Per il passaggio in coltura, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 1x PBS sterile. Aggiungere abbastanza 0,05% di tripsina per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.</li>
	<li>Neutralizzare la tripsina con mezzo mESC e pipetta per generare sospensione monocellulare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Contare le cellule con un emocitometro o un contatore cellulare e seminare circa 5,0 x 105 cellule in una piastra di coltura di 10 cm.</li>
	<li>Risospese le cellule in 10 mL di mezzo mESC, placcare le cellule sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza. NOTA: Si raccomanda di passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Quindi, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.</li>
</ol>2. Differenziazione di EB, NPC e neuroni
<ol><li>Eseguire il protocollo di passaggio di coltura menzionato in precedenza e contare le cellule (passaggi 1.7-1.10).</li>
	<li>Metodo di goccia sospesa (giorno 0)<ol>
<li>Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 104 cellule in cui 5,0 x 102 cellule saranno sospese in un mezzo di differenziazione da 20 μL (DMEM con 15% FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina / streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μL contenenti le cellule possono essere placcate su una piastra da 10 cm.</li>
		<li>Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospese le cellule nel volume appropriato del mezzo di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 102 cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 104 cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).</li>
		<li>Utilizzando una micropipetta o una pipetta ripetitore, posizionare 20 μL di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurati che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per impedire loro di fondersi. NOTA: le goccioline possono essere placcate su una piastra di fissaggio trattata con coltura di tessuto o su una piastra di sospensione in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piallare le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferirle su una piastra di sospensione come descritto di seguito.</li>
		<li>Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C. NOTA: PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno 2,utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 cm riempita con 10 ml di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura su uno shaker orbitale che scuote a bassa velocità nell'incubatore.</li>
	<li>Il giorno 4,per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 min e rimuovere il surnatante. NOTA: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi.</li>
	<li>Per continuare la procedura e indurre la differenziazione EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il mezzo di differenziazione con acido retinoico (RA) da 5 μM.</li>
	<li>Rimuovere il vecchio mezzo pellettizzando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio mezzo. Aggiungere 10 ml del mezzo di differenziazione contenente 5 μM RA alla piastra di coltura.</li>
	<li>Il giorno 6, sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente 5 μM RA inclinando la piastra e pipettando il mezzo come descritto sopra. NOTA: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente RA nei giorni 5 e 7. Prendi nota dell'indicatore rosso fenolo; se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il mezzo.</li>
	<li>Il giorno 8,raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante. NOTA: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può anche essere usato come alternativa alla tripsina.</li>
	<li>Per continuare la procedura e differenziare gli NPC in neuroni, raccogliere gli NPC in un tubo conico da 15 ml mediante centrifugazione, dissociarli con tripsina e incubarli a 37 °C per 3 min. Pipettare gli NPC per garantire che tutti gli aggregati NPC siano dissociati e neutralizzare la tripsina con il mezzo.</li>
	<li>Filtrare le cellule con un colino di cellule di nylon da 40 μm e contare le cellule prima di placcarle ad una densità di 1,5 x10 5/cm2 in mezzo N2 (DMEM/F12 medio + 3 mg/mL di glucosio + 3 mg/mL di albumina sierica bovina ricca di lipidi (LBSA) + supplemento di 1:100 N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL penna/streptococco + 1 mM di L-glutammina) su una piastra trattata con colture tissutali per successivi esperimenti di PCR e western blot; o su una camera di coltura tissutale per esperimenti di immunofluorescenza.</li>
	<li>Il giorno 9, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo N2 fresco.</li>
	<li>Il giorno 10,cambiare il mezzo N2 con il mezzo N2 / B27 (50% DMEM / F12 e 50% basale neurale, 3 mg / mL LBA, 1: 200 N2 supplemento, 1: 100 B27 supplemento, 50 U / mL penna / streptococco e 1 mM L-glutammina).</li>
	<li>Nei giorni 11-12, raccogliere i neuroni come segue. Lavare le cellule con 1x PBS, aggiungere tripsina e incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C per 3 minuti prima di neutralizzare la tripsina con mezzo e centrifugare a 200 x g per 3 min.</li>
</ol>3. Caratterizzazione di mESC e cellule differenziate
<ol><li>Saggio della fosfatasi alcalina (AP) 
	<ol>
<li>Utilizzare un kit per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura e lavare gli ESC con 1x PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL della soluzione fissa (composta da formaldeide e metanolo) fornita con il kit alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2-5 minuti. NOTA: l'eccessiva incubazione nella soluzione di correzione può compromettere l'attività pa.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione fissa, lavare gli ESC con 1x PBS e lasciare una certa quantità di PBS nella piastra. NOTA: mantenere le ESC umide in PBS per non compromettere l'attività AP.</li>
		<li>Preparare la soluzione AP mescolando le soluzioni di substrato A, B e C con un rapporto 1:1:1. Mescolare prima le soluzioni A e B e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti prima di aggiungere la soluzione C.</li>
		<li>Rimuovere il PBS 1x e aggiungere la soluzione AP preparata in precedenza.</li>
		<li>Incubare gli ESC per circa 15 minuti al buio avvolgendo la piastra di coltura con un foglio di alluminio o eseguendo il passaggio 3.5 in una stanza buia.</li>
		<li>Monitorare la reazione e rimuovere la soluzione di reazione quando la soluzione diventa luminosa per evitare macchie non specifiche.</li>
		<li>Lavare gli ESC due volte con 1x PBS.</li>
		<li>Evitare che il campione si asciughi coprendo gli ESC con 1x PBS o mezzo di montaggio. NOTA: per l'espressione AP verrà visualizzata una macchia rossa o viola. La piastra può essere conservata in frigorifero a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule in varie fasi seguendo i passaggi 1.6-1.7 e 2.4 rispettivamente per ESC ed EB e NPC.</li>
		<li>Isolare l'RNA utilizzando RNA, DNA e soluzione di estrazione proteica (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Genera cDNA con un kit di trascrittasi inversa (vedi la Tabella dei materiali)e segui il manuale del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissazione e incorporamento 
	<ol>
<li>Raccogliere EB e NPC come descritto sopra (fase 2.6) e fissarli con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il PFA e lavare il campione con 1x PBS per 5 minuti.</li>
		<li>Posizionare il campione in una diluizione seriale di 1s PBS, 10%, 20% e 30% di saccarosio a 25\u201228 °C, dove il campione viene trasferito alla soluzione successiva dopo 30 minuti di incubazione. NOTA: Il campione può essere conservato nella soluzione di saccarosio al 30% a 4 °C prima di continuare con la fase di incorporamento.</li>
		<li>Bagnare la punta della pipetta con soluzione di saccarosio prima di posizionare il campione (senza impilarli) al centro del criostampo e pipettare il liquido in eccesso. NOTA: la carta da filtro può essere utilizzata anche per rimuovere la soluzione in eccesso. Bagnare la punta della pipetta con una soluzione di saccarosio è importante per evitare che gli EB e gli NPC si attacchino alle pareti della punta.</li>
		<li>Aggiungere con attenzione la soluzione a temperatura di taglio ottimale (OCT) allo stampo senza sospescere nuovamente i campioni e rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.</li>
		<li>Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per agitare leggermente il campione per 15 minuti. Questo aiuta a sistemare gli EB e gli NPC verso il basso se vengono risospesi nella soluzione OCT.</li>
		<li>Congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido o su ghiaccio secco. NOTA: i campioni possono essere conservati in un congelatore a -70 °C prima di passare al passaggio successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Criosezione 
	<ol>
<li>Impostare il criostato in modo che si raffreddi a -20--18 °C prima di trasferire il campione allo strumento.</li>
		<li>Staccare il blocco OCT congelato dallo stampo e fissarlo sul supporto con una piccola soluzione OCT posizionata sulla superficie del supporto.</li>
		<li>Allineare il blocco dello Strumento di personalizzazione di Office in modo che gli NB e gli NPC siano più vicini al pannello per garantire che il campione non vada perso durante il sezionamento.</li>
		<li>Sezionare con attenzione 10 μm del blocco e prestare molta attenzione alle fette che contengono il campione.</li>
		<li>Posizionare rapidamente la fetta OCT contenente il campione sul vetrino di vetro che incorpora il tessuto e lasciare asciugare all'aria le fette OCT per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: I campioni possono essere conservati a -70 °C per un uso successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescenza (IF) 
	<ol>
<li>Blocca sezioni OCT o camere di coltura contenenti neuroni in 10% di siero d'asino normale / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.</li>
		<li>Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio.</li>
		<li>Incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero d'asino normale al 5% / Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio, quindi incubare i campioni in 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Montare i campioni con un coperchio e un mezzo di montaggio e lasciarlo asciugare.</li>
		<li>Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi RNA-seq 
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule in varie fasi ed eseguire l'estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 3.2).</li>
		<li>Preparare le librerie di cDNA, eseguire il sequenziamento profondo e l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto in Wang et al.8.</li>
		<li>Eseguire l'analisi gene ontology (GO) utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria a flusso 
	<ol>
<li>Raccogliere le ESC seguendo i passaggi 1.6-1.7 e risospensionare le celle nel mezzo. Raccogliere gli EB e gli NPC seguendo il passaggio 2.4 e risospensionare le cellule nel mezzo.</li>
		<li>Filtrare la sospensione cellulare utilizzando il filtro per celle di nylon da 40 μm in un nuovo tubo conico da 15 ml.</li>
		<li>Misurare il segnale GFP dei campioni utilizzando il citometro a flusso (eseguito dalla struttura principale dell'istituzione).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt/mTOR+pathway+in+cancer+stem/progenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma.">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li><li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings.">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li><li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.

Il metodo per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo è stato stabilito per decenni e i ricercatori hanno continuato a modificare i protocolli precedenti o crearne di nuovi per vari scopi7,10,11. Abbiamo utilizzato una serie di saggi per analizzare in modo completo l'efficienza e il progresso delle fasi di differenziazione delle mESC ai neuroni, che possono essere utilizzate nell'analisi di altre ...

Fin dalla loro prima derivazione dalla massa cellulare interna delle blastocisti di topo in via di sviluppo1,2,le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono state utilizzate come potenti strumenti per studiare l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali3. Inoltre, lo studio della differenziazione mESC porta a un'enorme comprensione dei meccanismi molecolari che possono migliorare l'efficienza e la sicurezza nella terapia basata sulle cellule staminali nel trattamento di malattie come i disturbi neurodegenerativi4. Rispetto ai modelli animali, questo sistema in vitro offre molti vantaggi, tra cui semplicità nella pratica e nella valutazione, basso costo nel mantenimento delle linee cellulari in contrasto con gli animali e relativa facilità nelle manipolazioni genetiche. Tuttavia, l'efficienza e la qualità dei tipi di cellule differenziate sono spesso influenzate da diverse linee di mESC e dai metodi di differenziazione5,6. Inoltre, i saggi tradizionali per valutare l'efficienza della differenziazione si basano sull'esame qualitativo di geni marcatori selezionati che mancano di robustezza e quindi non riescono a cogliere i cambiamenti globali nell'espressione genica.
Qui miriamo a utilizzare una batteria di saggi per la valutazione sistematica della differenziazione neuronale. Utilizzando sia le tradizionali analisi in vitro su marcatori selezionati che l'RNA-seq, stabiliamo una piattaforma per la misurazione dell'efficienza di differenziazione e dei cambiamenti trascrittomici durante questo processo. Sulla base di un protocollo precedentemente stabilito7,abbiamo generato corpi embrioidi (EB) attraverso la tecnica della goccia sospesa, seguita dall'induzione utilizzando la quantità soprafisiologica di acido retinoico (RA) per generare cellule progenitrici neurali (NPC), che sono state successivamente differenziate in neuroni con mezzo di induzione neurale. Per esaminare l'efficienza del differenziamento, oltre ai tradizionali test RT-qPCR e immunofluorescenza (IF), abbiamo eseguito RNA-seq e citometria a flusso. Queste analisi forniscono una misurazione completa della progressione della differenziazione specifica dello stadio.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Collected from MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#039;</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#039;</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mNeuroD1 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mOct4 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#039;</td></tr><tr><td>mPax6 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#039;</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin primary antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament primary antibody</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>- Potassium chloride</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium chloride</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

Descriviamo la procedura passo-passo per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali, seguita da una serie di saggi per caratterizzare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali di topo E14 sono state utilizzate per formare corpi embrioidi attraverso il metodo della goccia sospesa, e poi indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali dall'acido retinoico e infine differenziate in neuroni. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e gli esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che i progenitori neurali e i neuroni mostrano marcatori corrispondenti (nestina per i progenitori neurali e neurofilamento per i neuroni) rispettivamente al giorno 8 e 12 post-differenziazione. Esperimenti di citometria a flusso su una linea E14 che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 hanno mostrato che circa il 60% delle cellule al giorno 8 sono GFP positive, indicando la differenziazione di successo delle cellule progenitrici neurali in questa fase. Infine, l'analisi RNA-seq è stata utilizzata per profilare i cambiamenti trascrittomici globali. Questi metodi sono utili per analizzare il coinvolgimento di geni e percorsi specifici nella regolazione della transizione dell'identità cellulare durante la differenziazione neuronale.

Come rappresentazione del nostro metodo, abbiamo eseguito un esperimento di differenziazione EB, NPC e neuroni su cellule E14. Le cellule E14 sono state coltivate su MEF irradiati γ (Figura 1A) fino a quando la popolazione meF irradiata γ non si è diluita. Abbiamo confermato la pluripotenza delle cellule E14 eseguendo la colorazione della fosfatasi alcalina (AP)(Figura 1B)e successivamente RT-qPCR (vedi sotto) per i marcatori Nanog e Oct4. L...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.8K Views.  Penn State Hershey Cancer Institute. Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Video: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Neuroscienze

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologia

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

Source: Hanafiah, A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61446">Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

Generazione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali di topo con il metodo della goccia sospesa

1. mESC culture

	Coat a 10 cm tissue-culture-treated plate with 0.1% gelatin and allow the gelatin to set for at least 15&#8211;30 min before aspirating ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in progenitori neurali

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

Advanced Neuronal Models

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Una tecnica per generare cellule progenitrici neurali da cellule staminali embrionali di topo

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.