Il colesterolo elevato è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari e neurodegenerative. I nostri protocolli forniscono strumenti preziosi per studiare le conseguenze fisiologiche e meccaniche dell'ipercolesterolemia. Queste procedure possono essere eseguite utilizzando attrezzature di laboratorio di base e sono applicabili a cellule, tessuti e ovociti Xenopus.
Il colesterolo è un componente importante delle membrane cellulari in tutto il corpo. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare l'impatto di elevati livelli di colesterolo in qualsiasi tipo di cellula. Sezionare le arterie è il passo più difficile.
Rimuovere con cura l'arteria dal cervello, senza allungare o danneggiare il tessuto vascolare. I lipidi sono molto delicati e lavorare con loro è più un'arte che una scienza. La dimostrazione video fornisce una guida per imparare a gestire attentamente i lipidi.
Per preparare la soluzione di metil-beta-ciclodestrina satura di colesterolo, aggiungere prima 064 grammi di metil-beta-ciclodestrina a 10 millilitri di PBS, mescolando la soluzione con una barra di agitazione, per assicurarsi che la metil-beta-ciclodestrina si dissolva completamente. Successivamente, aggiungere 0024 grammi di polvere di colesterolo al pallone e mescolare vigorosamente la soluzione, usando una spatola per rompere il maggior numero possibile di blocchi di colesterolo. Quando quasi tutto il colesterolo è stato sciolto, sigillare il pallone con almeno due strati di pellicola di paraffina.
E scuotere il pallone a circa 30 oscillazioni al minuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo otto o 16 ore, raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, prima di filtrare la miscela attraverso un filtro siringa in polieteresolfone da 22 micrometri in una bottiglia di classe. Per l'arricchimento dell'arteria cerebrale dei mammiferi, raccogliere il cervello da un ratto Sprague Dawley da 250 a 300 grammi in un becher di PBS sul ghiaccio, prima di trasferire il cervello in una ciotola di dissezione cerata, al microscopio sezionato, contenente appena abbastanza PBS per immergere il tessuto.
Fissare il cervello con due o tre perni, assicurandosi che non penetrino nei vasi sanguigni. E usare forcep affilate e piccole forbici chirurgiche per sezionare delicatamente le arterie cerebrali e i loro rami che formano il Cerchio di Willis alla base del cervello. Successivamente, sciacquare brevemente segmenti di arteria lunghi fino a un centimetro in PBS, prima di incubare i segmenti risciacquati in una soluzione che arricchisce il colesterolo sufficiente a coprire i tessuti.
Per determinare eventuali alterazioni del livello di colesterolo, utilizzare una bottiglia fresca di polvere di filippina per preparare una soluzione di brodo da 10 milligrammi per millilitro del colorante nel solfossido di dimetile e lavare i tessuti arricchiti di colesterolo con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco. Dopo l'ultimo lavaggio, fissare i segmenti dell'arteria in paraformaldeide al 4% per 15 minuti sul ghiaccio, protetti dalla luce, prima di permeabilizzare i campioni nel 5%Triton in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i tessuti con tre lavaggi di cinque minuti in PBS su uno shaker, prima di aggiungere i campioni a una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro di soluzione di colorante filippino, per un'ora a temperatura ambiente, protetta dalla luce.
Alla fine dell'incubazione, lavare i pezzi dell'arteria tre volte come dimostrato, seguito da un breve risciacquo con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare un tessuto da laboratorio per assorbire qualsiasi liquido in eccesso e montare le arterie su uno scivolo utilizzando un mezzo di montaggio appropriato. Coprire con cura le arterie con un coperchio scivolare, facendo attenzione a evitare il rotolamento o la torsione del tessuto, e lasciare asciugare lo scivolo per 24 ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
Quando il mezzo di montaggio è asciutto, sigillare i bordi dello slittamento del coperchio con smalto chiaro e lasciare asciugare lo smalto per 10-15 minuti. Quindi, immagina il tessuto con un'eccitazione da 340 a 380 nanometri e un'emissione da 385 a 470 nanometri. Per preparare la dispersione a base fosfolipidica, combinare 200 microlitri da 10 milligrammi per millilitro cloroformio soluzione lipidica disciolta, L-alfa-fosfatidiletanolammina, 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterolo in un tubo di vetro da 12 millilitri.
Evaporare il cloroformio nella cappa sotto un flusso di azoto, prima di sospendere i lipidi in 800 microlitri di cloruro di potassio tamponato da 150 millimolare e soluzione di Tris HEPES da 10 millimolare. Quindi sigillare il tubo con pellicola di paraffina e sonicare delicatamente il contenuto del tubo a 80 kilohertz per 10 minuti, fino a formare una miscela lattina. Per l'arricchimento del colesterolo degli ovociti xenopus, utilizzare forcep affilati per interrompere il sacco ovarico da una rana Xenopus laevis femmina in più regioni e posizionare i pezzi dell'ovaio in una piastra di 60 millimetri con cinque millilitri di ND96 senza calcio integrati con 5 milligrammi per millilitro di collagenasi.
Agitare il tessuto su uno shaker orbitale a 60 oscillazioni al minuto per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di trasferimento con un'ampia punta per pipettare vigorosamente l'ovociti contenente la soluzione da cinque a 10 volte per isolare i singoli ovociti e sciacquare rapidamente la soluzione di ovociti scuri con ND96 fresco privo di calcio fino a quando la soluzione diventa trasparente. Successivamente, trasferire 90 microlitri della dispersione a base di fosfolipide arricchita di colesterolo in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti e aggiungere fino a sei ovociti al pozzo con il meno mezzo possibile.
Posizionare la piastra del pozzo 96 su un rotatore a piattaforma tridimensionale per cinque-10 minuti. Quindi aggiungere una goccia di ND96 al pozzo e trasferire gli ovociti arricchiti di colesterolo su una piastra di 35 millimetri contenente ND96 per la loro analisi immediata. Qui, un esempio di uno strato muscolare liscio dell'arteria cerebrale immagine dimostra l'aumento dipendente dalla concentrazione della fluorescenza associata alla filina ottenuta dall'arricchimento dei tessuti con crescenti concentrazioni di colesterolo.
In particolare tre ore dopo il trattamento con il complesso di colesterolo metil-beta-ciclodestrina i livelli di colesterolo sono diminuiti di circa il 50% rispetto al loro livello immediatamente dopo l'arricchimento. Mentre un tempo di incubazione di un'ora è comunemente usato per arricchire i tessuti e le cellule con colesterolo durante questo approccio, cinque minuti di incubazione sono solitamente sufficienti per ottenere un aumento statisticamente significativo del contenuto di colesterolo arterioso cerebrale determinato dal test biochimico a base di colesterolo ossidasi. Mentre non si osserva alcun cambiamento significativo nei livelli di colesterolo negli ovociti xenopus arricchiti con dispersioni a base fosfolipidica di controllo prive di colesterolo, i livelli di colesterolo aumentano significativamente dopo soli cinque minuti di trattamento con le dispersioni a base fosfolipidica che includono colesterolo e rimangono a questo livello quando il tempo di incubazione è aumentato a 60 minuti.
L'efficacia dell'approccio basato sulla ciclodestrina per le cellule arricchenti è dimostrata anche nei neuroni appena isolati dalla regione CA1 dell'ippocampo. Infatti, l'incubazione dei neuroni in metil-beta-ciclodestrina satura di colesterolo per 60 minuti si traduce in un aumento oltre due volte dei livelli di colesterolo, come valutato dalla fluorescenza associata filippina. Nel complesso, i due passaggi più importanti per queste procedure sono preparare la miscela di arricchimento del colesterolo e garantire l'integrità del tessuto arterioso.
Dopo l'arricchimento del colesterolo, si può studiare la funzione delle proteine che sono colpite da ipercolesterolemia. La capacità di arricchire le cellule con colesterolo ha facilitato lo studio di elevati livelli di colesterolo nei cardiomiociti e nei neuroni. L'uso di ovociti ci ha permesso di indagare come il colesterolo si lega ai canali ionici.
Un camice da laboratorio e guanti che viene sempre indossata per questo protocollo. La cloroformio e la paraformaldeide devono essere utilizzati sotto una cappa aspirante ed essere scartati come rifiuti pericolosi.
