כולסטרול גבוה הוא גורם סיכון עיקרי למחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות. הפרוטוקולים שלנו מספקים כלים בעלי ערך לחקר ההשלכות הפיזיולוגיות והמכוניסטיות של היפרכולסטרולמיה. הליכים אלה יכולים להתבצע באמצעות ציוד מעבדה בסיסי, והם חלים על תאים, רקמות, ו קסנופוס oocytes.
כולסטרול הוא מרכיב מרכזי של קרום הסלולר בכל הגוף. טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של רמות גבוהות של כולסטרול בכל סוג תא. ניתוח העורקים הוא הצעד הקשה ביותר.
בזהירות להסיר את העורק מהמוח, מבלי למתוח או לפגוע ברקמת כלי הדם. שומנים הם עדינים מאוד, ולעבוד איתם הוא יותר אמנות מאשר מדע. הדגמת וידאו מספקת מדריך ללימוד כיצד לטפל בזהירות בליפידים.
כדי להכין את הכולסטרול רווי מתיל-בטא-cyclodextrin פתרון, תחילה להוסיף 064 גרם של מתיל-בטא-cyclodextrin ל 10 מיליליטר של PBS, ערבוב הפתרון עם בר ערבוב, כדי להבטיח כי מתיל-בטא-cyclodextrin מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן, מוסיפים 0024 גרם של אבקת כולסטרול לבקבוק, ומערבבים את הפתרון במרץ, באמצעות מרית כדי לשבור כמו גושי כולסטרול רבים ככל האפשר. כאשר כמעט כל הכולסטרול כבר מומס, לאטום את הבקבוק עם לפחות שתי שכבות של סרט פרפין.
ולנער את הבקבוק בערך 30 תנודות לדקה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר שמונה עד 16 שעות, מצננים את הפתרון לטמפרטורת החדר, לפני סינון התערובת באמצעות מסנן מזרק פוליאתרשולפון 22 מיקרומטר לתוך בקבוק בכיתה. להעשרת עורק המוח של יונקים, לקצור את המוח מ 250 עד 300 גרם Sprague Dawley עכברוש לתוך PBS על קרח, לפני העברת המוח לתוך קערת ניתוח שעווה, תחת מיקרוסקופ מנתח, המכיל מספיק PBS כדי להטביע את הרקמה.
לאבטח את המוח עם שניים עד שלושה סיכות, לוודא שהם לא לחדור כלי דם. ולהשתמש במטלפים חדים ומספריים כירורגיים קטנים כדי לנתח בעדינות את העורקים המוחיים ואת ענפיהם שיוצרים את מעגל ויליס בבסיס המוח. לאחר מכן, שטפו לזמן קצר עד לסנטימטר אחד של מקטעי עורקים ארוכים ב- PBS, לפני הדגירה של המקטעים השטיפים בתתכנות מעשירה מספיק כולסטרול כדי לכסות את הרקמות.
כדי לקבוע שינויים ברמת הכולסטרול, השתמש בבקבוק טרי של אבקת פיליפין כדי להכין 10 מיליגרם לכל מיליליטר פתרון מלאי של הצבע דימתיל סולפוקסיד, ולשטוף את הרקמות מועשר כולסטרול עם שלוש חמש דקות שטיפות PBS טרי. לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את מקטעי העורק ב 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות על קרח, מוגן מפני אור, לפני permeabilizing את הדגימות ב 5% טריטון ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות עם שלוש חמש דקות שטיפה PBS על שייקר, לפני הוספת הדגימות ל 25 מיקרוגרם למיליליטר ריכוז סופי של פתרון צבע פיליפיני, במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, לשטוף את חתיכות העורק שלוש פעמים כפי שהוכח, ואחריו שטיפה קצרה עם מים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש ברקמת מעבדה כדי לספוג כל נוזל עודף, ולהוות את העורקים על מגלשה באמצעות מדיום הרכבה מתאים. בזהירות לכסות את העורקים עם להחליק כיסוי, דואג להימנע מתגלגל או פיתול של הרקמה, ולתת את השקופית יבש במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
כאשר מדיום ההרכבה יבש, לאטום את קצוות החלקת הכיסוי עם לק ברור, ולאפשר לק להתייבש במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, תמונה הרקמה עם העירור של 340 עד 380 ננומטר, ו פליטה של 385 עד 470 ננומטר. כדי להכין את הפיזור מבוסס פוספוליפיד, לשלב 200 microliters של 10 מיליגרם לכל מיליליטר כלורופורם מומס תמיסת השומנים, L-אלפא-phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-גליצרו-3-פוספוכולין, וכולסטרול בצינור זכוכית 12 מיליליטר.
לאדות את כלורופורם במכסה המנוע תחת זרם של חנקן, לפני השעיית השומנים ב 800 microliters של אשלגן כלורי 150 מילימולרי ו 10 מילימולר טריס HEPES פתרון. לאחר מכן לאטום את הצינור עם סרט פרפין, בעדינות sonicate את תכולת הצינור ב 80 קילוהרץ במשך 10 דקות, עד תערובת חלבית נוצרת. להעשרת כולסטרול של קסנופוס oocytes, להשתמש במטליות חדות כדי לשבש את הסק השחלות מצפרדע נקבה Xenopus laevis באזורים מרובים, ולמקם את נתחי השחלה לתוך צלחת 60 מילימטר עם חמישה מיליליטר של סידן חינם ND96 בתוספת 5 מיליגרם למיליליטר של קולגן.
לנער את הרקמה על שייקר מסלולית ב 60 תנודות לדקה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, השתמשו בפיפלטת העברה עם קצה רחב כדי לפעום במרץ את ה-oocyte המכיל פתרון חמש עד עשר פעמים כדי לבודד את הוציטים הבודדים, ולשטוף במהירות את תסנובת האוציטים הכהים עם ND96 נטול סידן טרי עד שהפתרון הופך לשקוף. לאחר מכן, להעביר 90 microliters של כולסטרול מועשר פוספוליפיד מבוסס פיזור לתוך באר אחת של צלחת 96 גם, ולהוסיף עד שישה oocytes ל הבאר עם מדיום קטן ככל האפשר.
מניחים את צלחת 96 היטב על מסובב פלטפורמה תלת מימדי במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן להוסיף טיפה של ND96 לגם, ולהעביר את הכולסטרול מועשר oocytes לצלחת 35 מילימטר המכיל ND96 לניתוח המיידי שלהם. כאן, דוגמה של שכבת שריר חלק עורק מוחי בתמונה מדגים את הגידול תלוי הריכוז פלואורסצנטיות הקשורים פיליפין המתקבל על העשרת רקמות עם ריכוזים הולכים וגדלים של כולסטרול.
יש לציין כי שלוש שעות לאחר הטיפול במתחם הכולסטרול מתיל-בטא-ציקלודקסטרין רמות הכולסטרול ירדו בכ-50% בהשוואה לרמתן מיד לאחר ההעשרה. בעוד זמן הדגירה של שעה אחת משמש בדרך כלל כדי להעשיר את הרקמות והתאים עם כולסטרול במהלך גישה זו, חמש דקות של דגירה הוא בדרך כלל מספיק כדי להשיג עלייה משמעותית סטטיסטית בתכלית כולסטרול עורקי מוחי כפי שנקבע על ידי כולסטרול אוקסידזה מבוסס בדיקות ביוכימיות. אמנם אין שינוי משמעותי נצפתה ברמות הכולסטרול ב קסנופוס oocytes מועשר שליטה פוספוליפיד מבוסס פיזור חסר כולסטרול, רמות הכולסטרול להגדיל באופן משמעותי לאחר חמש דקות בלבד של טיפול עם זרחונים מבוססי פיזור הכוללים כולסטרול, ולהישאר ברמה זו כאשר זמן הדגירה הוא גדל ל 60 דקות.
האפקטיביות של הגישה מבוססת cyclodextrin להעשרת תאים מוכחת גם נוירונים מבודדים טריים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס. אכן, דגירה של הנוירונים במתיל-בטא-ציקלודקטרין רווי כולסטרול במשך 60 דקות גורמת לעלייה של יותר פי שניים ברמות הכולסטרול, כפי שהוערך על ידי הפלואורסצנטיות הפיליפינית הקשורה. בסך הכל, שני הצעדים החשובים ביותר עבור הליכים אלה הם הכנת תערובת העשרת הכולסטרול ולהבטיח את שלמות רקמת העורקים.
בעקבות העשרת הכולסטרול, ניתן ללמוד את תפקוד החלבונים המושפעים מהיפרכולסטרולמיה. היכולת להעשיר תאים עם כולסטרול הקלה על המחקר של רמות כולסטרול גבוהות בקרדיומיוציטים ונוירונים. השימוש בוציטים איפשר לנו לחקור כיצד כולסטרול נקשר לערוצי היונים.
חלוק מעבדה וכפפות היא תמיד להיות משוחק לפרוטוקול זה. יש להשתמש בכלורופורם ובפרפורמלדהיד מתחת למכסה המנוע ולהשליך אותם כפסולת מסוכנת.
