Questa tecnica facilita l'osservazione in tempo reale dell'attività sinaptica del calcio come parametro fisiologico per i processi cellulari alla base dell'apprendimento e della formazione della memoria nella drosophila melanogaster. Confrontando le risposte neuronali agli odori prima e dopo l'allenamento associativo, possiamo trarre correlazioni dirette tra l'attività sinaptica e la formazione della traccia di memoria nei singoli moscerini della frutta. Produrre moscerini della frutta transgenici in cui specifici neuroni di interesse esprimono un indicatore di calcio geneticamente codificato incrociano mosche femminili-vergini e maschili portando i costrutti GAL4 e UAS desiderati, ed invecchiano la progenie femminile fino a tre o sei giorni dopo l'esclusione.
Per preparare una mosca per l'imaging, utilizzare forcep fini per posizionare una mosca anestetizzata dal ghiaccio in una camera di imaging preparata su misura. Uso di un microscopio sezionante per posizionare il torace e le gambe a contatto con i fili elettrici nella parte inferiore della camera e con la testa piatta. Fissare la mosca in posizione con nastro adesivo chiaro e utilizzare una lama chirurgica bisturi per tagliare una finestra nel nastro intorno alla testa, lasciando l'antenna coperta e solo la maggior parte anteriore del torace esposta.
Utilizzare un perno insetto tenuto da mascelle concave-convesse per circondare attentamente i lati e la parte posteriore della testa con colla di polimerizzazione della luce blu. E usa una lampada a LED che emette luce blu per impostare la colla. Quando la colla è completamente impostata, cancellare qualsiasi colla residua non indurente dalla superficie dorsale della testa della mosca e coprire la cuticola esposta della testa con una goccia della soluzione di Ringer.
Utilizzando un coltello da taglio a lama molto fine, tagliare la cuticola sul posteriore della testa, partendo dagli ocelli e tagliando ogni mediale laterale agli occhi per formare un lembo della cuticola che può essere facilmente strappato con le forcep. Rimuovere qualsiasi cuticola in eccesso che possa bloccare la regione cerebrale di interesse e utilizzare forcep fini per cancellare attentamente la superficie dorsale di qualsiasi trachea, facendo attenzione a evitare interruzioni del tessuto cerebrale stesso. Rimuovere e aggiornare la soluzione di Ringer se necessario per liberare l'area dai detriti tissutali.
E posizionare un ago ipodermico per la somministrazione di odori a circa un centimetro dalla testa della mosca, facendo attenzione non c'è nulla che possa ostacolare la consegna di odori all'antenna. Quindi collegare la camera di imaging al sistema di erogazione degli odori tramite l'ago di erogazione degli odori ipodermici. E lasciare che la mosca 10 minuti si riprenda dall'anestesia e dall'intervento chirurgico.
Per la visualizzazione degli indicatori di calcio basati su GFP, sintonizzare il laser di un microscopio multi-fotone dotato di un laser a infrarossi e di un obiettivo di immersione dell'acqua installato su un tavolo isolato dalle vibrazioni su una lunghezza d'onda di eccitazione di 920 nanometri e installare un filtro passa banda GFP. Usando la manopola di regolazione Z del corso, scansiona attraverso l'asse Z del cervello per individuare la regione cerebrale di interesse. Utilizzare la funzione di ritaglio per concentrare la scansione solo sull'area di interesse, per ridurre al minimo il tempo di scansione.
E ruotare la vista di scansione in modo che la parte anteriore della testa sia rivolta verso il basso. Quindi regola le dimensioni del fotogramma su 512 per 512 pixel e seleziona l'area da scansionare. Tenendo conto del tempo di scansione calcolato per ogni fotogramma, per ottenere una frequenza fotogrammi di almeno quattro hertz.
Per la visualizzazione transitoria del calcio evocata dall'odore, avviare un pacchetto macro pre-programmato in grado di collegare il software di acquisizione delle immagini e il programma di distribuzione degli odori e iniziare la misurazione nel software del microscopio per 6,25 secondi per stabilire un valore di base F0. Nel sistema di erogazione degli odori, fornire uno stimolo odore di 2,5 secondi qui indicato dall'illuminazione dei LED innescata dall'apertura e dalla chiusura di valvole specifiche della tazza di odore. Seguito da 12,5 secondi di registrazione alla fine dell'offset degli odori.
Quindi ripetere la consegna per un secondo e un terzo odore allo stesso modo. Per eseguire il condizionamento associativo in questa configurazione, utilizzare il sistema di erogazione degli odori controllato dal computer per presentare lo stimolo-plus-odore condizionato per 60 secondi insieme a 12 scosse elettriche da 90 volt. Dopo una pausa di 60 secondi presente lo stimolo condizionato-meno-odore da solo per 60 secondi senza scossa elettrica.
Misurare nuovamente l'odore post-allenamento evocato la caescenza del calcio ripetendo il protocollo di stimolazione degli odori pre-allenamento tre minuti dopo aver terminato la fase di allenamento. Quindi salvare i file di imaging in un formato appropriato per un'analisi successiva delle immagini. Qui si possono osservare immagini rappresentative dei neuroni di uscita del corpo dei funghi, acquisite come dimostrato.
La specifica espressione compartimentata del sensore dHomer-GCaMP3, che non è espressa nei compartimenti assonali del neurone, dimostra un segnale punteggiato nel compartimento dendritico. Risposte di odore di ampiezza chiare anche se più basse possono essere osservate nelle mosche che esprimono dHomer-GCaMp3, rispetto alle mosche che esprimono GCaMP6f citosolico. Qui, tracce rappresentative di calcio da una singola mosca dimostrano variazioni nel livello di rumore e nell'ampiezza che possono essere ottenute tra i singoli preparati.
Questa tecnica ha aperto la possibilità di visualizzare a livello subcellulare, come vengono modulate le rappresentazioni olfattive e come si formano le fasi della memoria attraverso il condizionamento. Tali esperimenti saranno fondamentali per espandere la nostra comprensione di strutture cerebrali complesse come il corpo fungo e per caratterizzare come i ricordi associativi sono conservati tra popolazioni distribuite di neuroni.
