هذه التقنية يسهل الملاحظة في الوقت الحقيقي من نشاط الكالسيوم متشابك كمعلمة فسيولوجية للعمليات الخلوية الكامنة تحت التعلم وتكوين الذاكرة في drosophila الميلانوغاستر. من خلال مقارنة استجابات الخلايا العصبية للروائح قبل وبعد التدريب النقابي ، يمكننا رسم روابط مباشرة بين النشاط المتشابك وتشكيل تتبع الذاكرة في ذباب الفاكهة الفردي. لإنتاج ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا التي الخلايا العصبية المحددة من الفائدة التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا عبر الإناث عذراء والذكور الذباب تحمل GAL4 المطلوب و UAS يبني، وعمر ذرية الإناث حتى ثلاثة إلى ستة أيام بعد eclosion.
لإعداد ذبابة للتصوير ، استخدم ملقطًا جيدًا لوضع ذبابة مُجَبَّنة في غرفة تصوير مخصصة. باستخدام مجهر تشريح لوضع الصدر والساقين في اتصال مع الأسلاك الكهربائية في الجزء السفلي من الغرفة، ومع الرأس ملقاة شقة. إصلاح ذبابة في مكان مع شريط لاصق واضح، واستخدام شفرة مشرط الجراحية لقطع نافذة في الشريط حول الرأس، وترك الهوائي مغطاة وفقط الجزء الأمامي معظم الصدر المكشوفة.
استخدام دبوس حشرة التي عقدت من قبل الفكين مقعر محدب لإحاطة بعناية الجانبين والظهر من الرأس مع الضوء الأزرق علاج الغراء. واستخدام الضوء الأزرق الباعثة مصباح LED لضبط الغراء. عندما يتم ضبط الغراء تمامًا ، قم بمسح أي غراء غير مُتَرَق من السطح الظهري لرأس الذبابة وغطّي بشرة الرأس المكشوفة مع قطرة من محلول Ringer.
باستخدام سكين طعنة مشفرة جدا، وقطع من خلال بشرة عبر الجزء الخلفي من الرأس، بدءا من ocelli وقطع كل ميديل الجانب إلى العينين لتشكيل رفرف من بشرة التي يمكن أن تمزق بسهولة باستخدام ملقط. إزالة أي بشرة الزائدة التي قد تمنع منطقة الدماغ من الفائدة واستخدام ملقط غرامة لمسح بعناية سطح الظهر من أي القصبة الهوائية، مع الحرص على تجنب اضطراب أنسجة الدماغ نفسها. إزالة وتحديث الحل Ringer 'ق حسب الضرورة لمسح المنطقة من الحطام الأنسجة.
ووضع حقنة تحت الجلد تسليم إبرة ما يقرب من سنتيمتر واحد من رأس الذبابة، مع الحرص لا يوجد شيء يمكن أن تعوق تسليم رائحة إلى الهوائي. ثم قم بتوصيل غرفة التصوير بنظام توصيل الرائحة عبر إبرة توصيل الرائحة تحت الجلد. وتسمح للذبابة 10 دقائق للتعافي من التخدير والجراحة.
للتصور من مؤشرات الكالسيوم GFP القائمة، ضبط ليزر من مجهر متعدد الفوتون مجهزة ليزر الأشعة تحت الحمراء وهدف الغمر المياه المثبتة على جدول اهتزاز معزولة إلى الطول الموجي إثارة من 920 نانومتر وتثبيت مرشح شريط النطاق GFP. باستخدام مسار Z مقبض التكيف، والمسح الضوئي من خلال Z-محور الدماغ لتحديد موقع منطقة الدماغ من الفائدة. استخدم وظيفة المحاصيل لتركيز المسح على المنطقة ذات الاهتمام فقط ، لتقليل وقت المسح الضوئي.
وتدوير عرض المسح الضوئي بحيث تواجه الأمامي من الرأس إلى أسفل. ثم اضبط حجم الإطار إلى 512 بكسل في 512 وحدد المنطقة المراد مسحها ضوئيًا. مع الأخذ في الاعتبار الوقت المسح المحسوب لكل إطار، لتحقيق معدل الإطار من أربعة هرتز على الأقل.
للتصور العابر للكالسيوم الذي يثير الرائحة ، ابدأ حزمة ماكرو مبرمجة مسبقًا قادرة على ربط برنامج الحصول على الصور وبرنامج تسليم الرائحة وتبدأ القياس في برنامج المجهر لمدة 6.25 ثانية لإنشاء قيمة خط أساس F0. في نظام تسليم الرائحة، وتقديم 2.5 ثانية من التحفيز رائحة المشار إليها هنا من خلال إضاءة LED التي أثارها فتح وإغلاق صمامات كأس رائحة محددة. تليها 12.5 ثانية من تسجيل في نهاية إزاحة رائحة.
ثم كرر التسليم لرائحة ثانية وثالثة بنفس الطريقة. لتنفيذ تكييف النقابي في هذا الإعداد، استخدم نظام تسليم رائحة الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتقديم التحفيز مشروطة زائد رائحة لمدة 60 ثانية جنبا إلى جنب مع 12 90 فولت الصدمات الكهربائية. بعد 60 ثانية كسر الحالي التحفيز مشروطة ناقص رائحة وحدها لمدة 60 ثانية دون صدمة كهربائية.
قياس رائحة ما بعد التدريب أثار الترانليس الكالسيوم مرة أخرى عن طريق تكرار بروتوكول التحفيز قبل التدريب رائحة ثلاث دقائق بعد الانتهاء من مرحلة التدريب. ثم احفظ ملفات التصوير في تنسيق مناسب لتحليل الصورة لاحقًا. هنا فطر تمثيلية الجسم إخراج صور الخلايا العصبية, المكتسبة كما هو موضح يمكن ملاحظتها.
التعبير المجزأ المحدد لاستشعار dHomer-GCaMP3، الذي لا يعبر عنه في مقصورات محور عصبي من الخلايا العصبية، يدل على إشارة متخللة في المقصورة التشعب. يمكن ملاحظة ردود واضحة على الرغم من انخفاض رائحة السعة في الذباب التعبير عن dHomer-GCaMp3، مقارنة بالذباب الذي يعبر عن cytosolic GCaMP6f. هنا، آثار الكالسيوم التمثيلية من ذبابة فردية واحدة يوضح التباينات في مستوى الضوضاء والسعة التي يمكن الحصول عليها بين الاستعدادات الفردية.
وقد فتحت هذه التقنية إمكانية تصور على المستوى الفرعي الخلوي، وكيف يتم تعديل التمثيلات الشمية وكيف يتم تشكيل مراحل الذاكرة من خلال تكييف. وستكون مثل هذه التجارب حيوية لتوسيع فهمنا لهياكل الدماغ المعقدة مثل جسم الفطر، وتوصيف كيفية تخزين الذكريات النقابية عبر مجموعات الخلايا العصبية الموزعة.
