Questo modello di cancro endometriale VX2 con metastasi del linfonodo retroperitoneale può essere utilizzato per studiare la tecnologia per la chirurgia guidata dall'immagine. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è affidabile, semplice e che crea una diffusione metastatica coerente, che imita il modello del cancro endometriale umano. Nel complesso, questa è una tecnica semplice.
Tuttavia, praticare la sutura prima di tentare di creare il modello aiuterà a semplificare il processo. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante, in quanto aiuta a dimostrare le fasi chirurgiche coinvolte nello stabilimento del modello. A dimostrare la procedura con Harley Chan e io saremo Lili Ding, un tecnico del nostro laboratorio.
Per preparare le cellule VX2 propagate in vitro per l'iniezione, iniziare riscaldando fiale congelate di cellule VX2 in un tallone o bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per un minuto. Quando le cellule si sono scongelate, tirare le sospensioni cellulari in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di coltura. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione.
Resuspend il pellet in nove millilitri di mezzo. Trasferire le cellule in un grande pallone da coltura per l'incubazione a 37 gradi Celsius senza tremare, controllando quotidianamente le cellule per la confluenza mediante microscopia leggera. Quando le celle hanno raggiunto l'80% di confluenza, aggiungere tre millilitri dello 0,2% di tripina al pallone e riportare le celle nell'incubatore di coltura cellulare per cinque minuti.
Quando le cellule si sono staccate, trasferire la sospensione cellulare su un tubo conico per raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Lavare il pellet cellulare tre volte con nove millilitri di PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, resospendare le cellule in PBS fresco per il conteggio prima di diluire a quattro volte 10 alle sette cellule VX2 per millilitro di concentrazione di PBS in un nuovo tubo conico sul ghiaccio.
Per preparare le cellule VX2 propagate in vivo per l'iniezione, scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati uno per un centimetro e utilizzare un bisturi per tritare i campioni di tessuto in una piastra di coltura. Trasferire i frammenti di tessuto in un filtro da 70 micrometri e aggiungere piccole aliquote fino a un millilitro della soluzione salina bilanciata di Hank, o HBSS, per garantire che tutte le cellule vengano passate attraverso il colino. Quindi contare le cellule prima di diluire la sospensione cellulare a una per 10 alle sette cellule VX2 per millilitro di concentrazione di HBSS in un tubo sterile sul ghiaccio.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta allo stimolo, posizionare il coniglio bianco della Nuova Zelanda anestetizzato nella posizione dorsale sulla tavola operatoria. Ritagliare i capelli sul bacino e sull'addome e utilizzare una preparazione chirurgica della pelle in tre gradini per pulire la pelle esposta. Indossando un berretto chirurgico e una maschera per il viso, strofinare le mani con disinfettante prima di indossare un abito sterile e guanti chirurgici sterili.
Punto di riferimento la parte superiore dell'osso pubico e drappeggiare il campo chirurgico con tende di laparotomia, lasciando esposta un'area di cinque per cinque centimetri dell'addome inferiore. Successivamente, utilizzare una lama bisturi numero 11 per fare un'incisione di 2,5 centimetri di un centimetro cranica alla sinfisi pubica attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo. Incidere la fascia del retto e sezionare lateralmente i muscoli del retto per esporre il peritoneo sottostante.
Verificare che il sottosuolo sia libero dall'intestino o da altri organi addominali. Entra bruscamente nel peritoneo per identificare la vescica urinaria e spazzare un dito guantato in modo superiore, posteriore e laterale sopra l'apice della vescica per localizzare le corna uterine. Estrarre le corna uterine attraverso l'incisione addominale per riposare sulla parete addominale.
Utilizzare una sutura assorbibile intrecciata 3-0 per eseguire una singola legatura sutura di ogni corno uterino, approssimativamente da 1,5 a due centimetri distale alle cervice e solo mediale alle arterie uterine. Quindi legare le suture comodamente per includere le corna uterine distali. Per inoculare il miometrio con la sospensione cellulare VX2 precedentemente preparata, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 con un millilitro di cellule.
Iniettare lentamente 0,5 millilitri della sospensione cellulare per oltre un minuto in ogni corno uterino prossimale al sito di sutura tra la sutura e la cervice. Quindi applicare pressione sul sito di iniezione miometriale per 30 secondi per ridurre al minimo la perdita di cellule. Ispezionare i siti di iniezione e sutura per l'emostasi prima di riposizionare le corna uterine nell'addome.
Per la chiusura profonda della parete addominale, identificare l'apice dell'incisione peritoneale e utilizzare un morsetto chirurgico per afferrare il muscolo retto del peritoneo e la fascia. Ancorare la sutura posizionando una sutura di polifilamento assorbibile 3-0, superficiale a profonda su un apice dell'incisione e da profonda a superficiale dall'altra. Usando la sutura attaccata, rendere i punti di corsa perpendicolari all'incisione attraverso gli strati della parete addominale, lavorando passo dopo passo lungo l'incisione da un lato all'altro prima di legare la sutura e tagliare le estremità sciolte.
Per la chiusura superficiale della parete addominale, utilizzare una sutura di polifilamento assorbibile sottocuticolare 3-0 sepolta per suturare da profonda a superficiale da un lato dell'incisione e superficiale a profondo dall'altro. Dopo aver annodato le suture, utilizzare le suture ancorate per rendere i punti di corsa nello strato dermico paralleli all'incisione, lavorando passo dopo passo lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare le suture e rimuovere le estremità sciolte.
Applicare la colla chirurgica sull'incisione chiusa per appostare i bordi della pelle. Quindi, posiziona l'animale su una coperta calda con ossigeno e monitoraggio, fino a quando l'animale non è vigile e in grado di sedersi in modo indipendente. Quando si stabilisce questo modello, una dose di due volte 10 alle sette cellule per corno uterino ha avuto successo in quattro conigli, in un tempo medio di 45 giorni dall'inoculazione all'esperimento ed è stata quindi determinata come la dose di iniezione ottimale per il modello VX2 coltivato.
Per il modello VX2 propagato in vivo, che è stato creato con successo in 16 conigli con un tempo medio dall'inoculazione all'esperimento di 29 giorni, cinque volte 10 alle sei cellule per corno uterino è stato determinato come la dose di iniezione ottimale. Tutti i modelli hanno portato ad una trasformazione metastatica di successo dei linfonodi retroperitoneali. Inoltre, tumori e linfonodi metastatici provenienti da cellule VX2 coltivate sono apparsi simili ai tumori delle cellule VX2 propagate in vivo mediante analisi istologica, con cellule macchiate di densimetoxolina osservate nel muscolo invasore e formando strutture ghiandolari come strutture con molte figure miotiche patologiche.
Posizionare la sutura mediale nell'arteria uterina per evitare sanguinamento da una puntura del vaso e fare attenzione a infiltrarsi nelle cellule nel miometrio e non nella cavità endometriale. Fare attenzione a utilizzare una corretta tecnica sterile durante la creazione del modello per prevenire l'infezione post-operatoria e proteggersi con il materiale bario durante l'intervento chirurgico.
