Este modelo de cáncer de endometrio VX2 con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales se puede utilizar para estudiar la tecnología para la cirugía guiada por imágenes. Las principales ventajas de esta técnica son que es fiable, simple, y que crea una difusión metastásica consistente, que imita el patrón del cáncer de endometrio humano. En general, esta es una técnica simple.
Sin embargo, practicar la sutura antes de intentar crear el modelo ayudará a facilitar el proceso. La demostración visual de esta técnica es importante, ya que ayuda a demostrar los pasos quirúrgicos involucrados en el establecimiento modelo. Demostrando el procedimiento con Harley Chan y yo estaremos Lili Ding, una técnico de nuestro laboratorio.
Para preparar células VX2 in vitro para inyección, comience calentando los viales congelados de las células VX2 en un cordón de 37 grados Celsius o un baño de agua durante un minuto. Cuando las células se hayan descongelado, tire de las suspensiones celulares en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de cultivo. Sedimentar las células por centrifugación.
Resuspender el pellet en nueve mililitros de medio. Transfiera las células a un gran matraz de cultivo para incubación a 37 grados celsius sin agitar, comprobando las células diariamente en busca de confluencia por microscopía de luz. Cuando las células hayan alcanzado el 80% de confluencia, agregue tres mililitros de 0,2% de trippsina al matraz y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante cinco minutos.
Cuando las células se hayan desprendido, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico para recoger las células por centrifugación. Lave el pellet celular tres veces con nueve mililitros de PBS fresco por lavado. Después del último lavado, resuspendir las células en PBS fresco para contar antes de diluir a un cuatro veces 10 a las siete células VX2 por mililitro de concentración de PBS en un nuevo tubo cónico en hielo.
Para preparar células VX2 propagadas in vivo para inyección, descongele los bloques tumorales VX2 congelados de uno por un centímetro y utilice un bisturí para picar las muestras de tejido en una placa de cultivo. Transfiera los fragmentos de tejido a un filtro de 70 micrómetros y agregue pequeñas alícuotas de hasta un mililitro de la solución de sal equilibrada de Hank, o HBSS, para asegurar que todas las células se pasen a través del colador. Luego cuente las células antes de diluir la suspensión celular a una de una por 10 a las siete células VX2 por mililitro de concentración de HBSS en un tubo estéril sobre hielo.
Después de confirmar la falta de respuesta al estímulo, coloque el conejo blanco anestesado de Nueva Zelanda en la posición dorsal en la mesa de operaciones. Sujeta el cabello sobre la pelvis y el abdomen, y usa una preparación quirúrgica de la piel de tres pasos para limpiar la piel expuesta. Usar una gorra quirúrgica y una mascarilla facial, frotar las manos con desinfectante antes de ponerse una bata estéril y guantes quirúrgicos estériles.
Marca la parte superior del hueso púbico y cubre el campo quirúrgico con cortinas de laparotomía, dejando una zona de cinco por cinco centímetros de la parte inferior del abdomen expuesta. A continuación, usa una hoja de bisturí número 11 para hacer una incisión de 2,5 centímetros de craneal a la sínfisis pubis a través de la piel y el tejido subcutáneo. Incitar el recto fascia y diseccionar los músculos del recto lateralmente para exponer el peritoneo subyacente.
Confirme que la superficie inferior está libre de intestino u otros órganos abdominales. Entra bruscamente en el peritoneo para identificar la vejiga urinaria y barre un dedo enguantado superior, posterior y lateralmente sobre el ápice de la vejiga para localizar los cuernos uterinos. Extraiga los cuernos uterinos a través de la incisión abdominal para descansar sobre la pared abdominal.
Utilice una sutura absorbible trenzada de 3-0 para realizar una sola ligadura de sutura de cada cuerno uterino, aproximadamente 1,5 a dos centímetros distales a los cuellos de cervicio y sólo medial a las arterias uterinas. A continuación, ate las suturas cómodamente para incluir los cuernos uterinos distales. Para inocular el miometrio con la suspensión celular VX2 previamente preparada, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 con un mililitro de células.
Inyecte lentamente 0,5 mililitros de la suspensión celular durante un minuto en cada cuerno uterino proximal en el lugar de la sutura entre la sutura y el cuello uterino. A continuación, aplique presión en el lugar de inyección miometrial durante 30 segundos para minimizar las fugas celulares. Inspeccione los sitios de inyección y sutura en busca de hemostasia antes de volver a colocar los cuernos uterinos en el abdomen.
Para el cierre profundo de la pared abdominal, identifique el ápice de la incisión peritoneal y utilice una abrazadera quirúrgica para agarrar el músculo peritoneo rectus y la fascia. Ancle la sutura colocando una sutura de polifilamento absorbible 3-0, superficial a profunda en un ápice de la incisión, y de profundidad a superficial en el otro. Usando la sutura adjunta, haga puntos de correr perpendiculares a la incisión a través de las capas de la pared abdominal, trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado antes de atar la sutura y cortar los cabos sueltos.
Para el cierre superficial de la pared abdominal, utilice un subcuticular enterrado 3-0 sutura de polifilamento absorbible para suturar de profundidad a superficial en un lado de la incisión y superficial a profundo en el otro. Después de anudar las suturas, utilice las suturas ancladas para hacer puntos de correr en la capa dérmica paralela a la incisión, trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado. Ate las suturas y retire los cabos sueltos.
Aplique pegamento quirúrgico a la incisión cerrada para aprete los bordes de la piel. Luego, coloque el animal en una manta caliente con oxígeno y monitoreo, hasta que el animal esté alerta y sea capaz de sentarse de forma independiente. Al establecer este modelo, una dosis de dos veces 10 a las siete células por cuerno uterino tuvo éxito en cuatro conejos, en un tiempo promedio de 45 días desde la inoculación hasta el experimento y por lo tanto se determinó como la dosis de inyección óptima para el modelo de VX2 cultivado.
Para el modelo VX2 propagado in vivo, que se creó con éxito en 16 conejos con un tiempo promedio desde la inoculación hasta el experimento de 29 días, cinco veces 10 a las seis células por cuerno uterino se determinó como la dosis de inyección óptima. Todos los modelos dieron lugar a una transformación metastásica exitosa de los ganglios linfáticos retroperitoneales. Además, los tumores y los ganglios linfáticos metastásicos de las células VX2 cultivadas parecían similares a los tumores de células VX2 propagadas in vivo mediante análisis histológicos, con células manchadas de densymetoxina observadas en el músculo invasor y formando estructuras glandulares con muchas figuras mitóticas patológicas.
Coloque la sutura medial en la arteria uterina para evitar el sangrado de una punción en el vaso y tenga cuidado de infiltrarse en las células en el miometrio y no en la cavidad endometrial. Tenga cuidado de utilizar la técnica estéril adecuada durante la creación del modelo para prevenir la infección postoperatoria y para protegerse con el material de bario durante la cirugía.
