La ricerca sulla biologia delle goccioline lipidiche è stata ostacolata dalla difficoltà di purificazione. Inoltre, lo studio del flusso lipidico cellulare richiede la purificazione simultanea di più organelli e al momento non erano disponibili protocolli semplici. Il principale vantaggio di questa tecnica è rendere più accessibile la purificazione delle goccioline lipidiche.
Abbiamo modificato un kit disponibile in commercio per isolare simultaneamente goccioline lipidiche, reticolo endoplasmatico e lisosomi da un singolo campione. L'accumulo di goccioline lipidiche epatiche predispone i pazienti obesi e alcolici alla malattia epatica progressiva. Ciò ha spostato la visione delle goccioline lipidiche dai compartimenti di stoccaggio inerti agli organelli dinamici biologicamente importanti.
Per iniziare, utilizzare forcep sterili e forbici di dissezione per tagliare la pelle e gli strati muscolari dell'addome del topo eutanasiato sull'asse posteriore anteriore, esponendo il fegato. Tagliare i legamenti che collegano il fegato all'intestino. Usando le forcep, allontanare l'intestino dal fegato, verso il posteriore.
Tagliare il legamento che collega il fegato al diaframma. Quindi, tagliare tra il fegato e la gabbia toracica dorsale, passando da anteriore a posteriore, fino a quando il fegato non viene liberato. Trasferire il fegato in una piastra di Petri fredda di cinque centimetri con 10 millilitri di PBS freddo 1x e lavare il fegato due volte su una piattaforma a dondolo in 10 millilitri di PBS freddo 1x per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo il lavaggio finale, versare il PBS 1x e utilizzare una lama chirurgica sterile di dimensioni 10 per tagliare a dadini il fegato in pezzi da tre a cinque millimetri all'interno del piatto. Quindi, lavare il fegato a dadini due volte con 10 millilitri di PBS freddo 1x per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il PBS 1x e trasferire i pezzi di fegato a dadini in un omogeneizzatore Dounce freddo da 45 millilitri, assicurando che tutti i pezzi siano sul fondo.
Aggiungere sette millilitri di tampone freddo 1x IE. Omogeneizzare sul ghiaccio spostando il pestello su e giù 20 volte, assicurandosi che il pestello vada sul fondo dell'omogeneizzatore durante ogni corsa. Trasferire l'omogeneato in un tubo di centrifuga freddo da 15 millilitri.
Risciacquare l'omogeneizzatore con un millilitro di tampone freddo 1x IE e aggiungerlo al resto dell'omogeneato. Per rimuovere i nuclei, centrifugare l'omogeneato in una centrifuga ad alta capacità a 1.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Assicurarsi che tutti i lipidi raccolti nella parte superiore del tubo da 15 millilitri vengano rimorsi per evitare la perdita di LD.
Assicurarsi che il pellet nucleare nella parte inferiore del tubo sia indisturbato, trasferire il supernatante post-nucleare contenente lipidi in un tubo di centrifuga fresco freddo da 50 millilitri. Trasferire un'aliquota di 100 microlitri del supernatante post-nucleare in un tubo di microcentrifugo freddo da 1,7 millilitri sul ghiaccio per una successiva analisi della purezza. Per rimuovere i mitocondri, centrifugare il campione di supernatante post-nucleare in una centrifuga refrigerata ad alta velocità a 12.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Assicurarsi che tutti i lipidi raccolti nella parte superiore del tubo vengano rimescolati per evitare la perdita di LD, quindi trasferire il supernatante post-mitocondriale in un tubo ultracentrifugo da 13 millilitri. Trasferire un'aliquota di 100 microlitri del supernatante post-mitocondriale in un tubo di microcentrifugo freddo da 1,7 millilitri sul ghiaccio per una successiva analisi della purezza. Riempire il tubo ultracentrifugo con supernatante post-mitocondriale fino all'orlo con tampone freddo 1x IE, per evitare che collassi durante l'ultracentrifugazione.
Bilanciare i campioni, quindi centrifugare in un ultracentrifugo a 100.000 volte g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere lo strato LD, inclinare il tubo con un angolo di 45 gradi e aspirare con una pipetta di vetro. Dopo aver trasferito il pellet in un tubo di microcentrifugo freddo da 1,7 millilitri, raccogliere 100 microlitri del supernatante post-ER sotto lo strato lipidico per l'analisi della purezza.
Per pellettizzare eventuali detriti cellulari, centrifugare in un microcentrifugo alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, riscaldare delicatamente il tubo con le mani per aiutare a rimescolare lo strato LD e trasferire il supernatante, incluso lo strato lipidico, in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri. Ripetere questi passaggi di lavaggio, riscaldando il tubo da due a tre volte, fino a quando il pellet non è più visibile.
Quindi, per lavare il supernatante LD privo di pellet, aggiungere 1x PBS a un volume finale di 1,5 millilitri e centrifugare in un microcentrifugo alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere un millilitro di 1x PBS, che si trova sotto lo strato lipidico, senza disturbare lo strato lipidico. Ripetere il lavaggio LD da quattro a cinque volte, fino a quando il PBS 1x non è visivamente trasparente senza torbidità.
Quindi, utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere tutti i 1x PBS sotto lo strato lipidico e utilizzare la frazione LD pura risultante per l'analisi a valle. Quando le immagini rappresentative 20x fluorescenti e brightfield LD sono state prese sia dall'isolamento LD del kit ER che dai metodi di isolamento LD del saccarosio, hanno rivelato livelli simili di particolato, suggerendo purità simili utilizzando due protocolli diversi. In seguito alla purificazione, i livelli di trigliceridi e proteine LD sono stati misurati utilizzando saggi colorimetrici e i dati sono stati normalizzati in base al peso epatico, dimostrando che quando il materiale di partenza è stato normalizzato, i trigliceridi LD e le rese proteiche erano simili usando il kit ER e il metodo del saccarosio.
I diametri LD sono stati quantificati utilizzando un software di analisi delle immagini, dimostrando che l'isolamento LD del kit ER e l'isolamento LD del saccarosio producevano LD di dimensioni simili. Per valutare la purezza dell'LD, i campioni sono stati analizzati mediante immunoblotting, dimostrando che i LD derivati dall'isolamento ER kit LD e dal protocollo gradiente di saccarosio avevano entrambi la stessa purezza. PLIN2, un marcatore LD, è stato rilevato in tutti i campioni ad eccezione del kit ER LD isolation PER e del PNS del saccarosio.
L'analisi di purezza di una frazione ER che utilizza immunobloti mostra che erano esente da marcatore LD PLIN2 ma avevano livelli significativi della proteina ER SEC61A. È stata inoltre valutata la purezza di una frazione lisosomiale dopo un'ulteriore purificazione dei lisosomi utilizzando il kit di arricchimento lisosoma. Discovery è attualmente l'applicazione più utile del nostro protocollo.
Eseguiamo lipidomici in organelli purificati e abbiamo mostrato che le lipotossine sono aumentate specificamente nelle goccioline lipidiche nella malattia epatica alcolica.
