Questo protocollo consente la produzione di filamenti di matrice extracellulare sfusa da linee cellulari coltivate, consentendo la ricerca sulle interazioni della matrice cellulare, nonché la ricerca sul potenziale di questo biomateriale per la riparazione delle ferite. Queste fibre sintetiche possono evitare la risposta del corpo estraneo diretta contro i materiali sintetici, pur attingendo al ricco repertorio di tecniche di fabbricazione tessile per creare una vasta gamma di impiantabili intrecciati. A dimostrare la procedura sarà Cassandra Reed, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Prima di seminare le cellule, autoclavare le membrane in fibra cava a 121 gradi Celsius per 30 minuti, seguita da un trattamento con 50 millilitri di fibronectina plasmatica bovina in PBS a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica per un'ora. Alla fine dell'incubazione, utilizzare micro forbici sterili per tagliare le fibre a sei centimetri o meno e utilizzare una siringa millilitro dotata di un ago calibro 21 per seminare una volta 10 alla quinta cellule fibroblatrici direttamente nell'apparecchio delle membrane in fibra cava. Mettere sei fibre sementi in una piastra di Petri di sei pollici di diametro e incubare brevemente le fibre sementi a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.
Dopo cinque minuti, trasferire le fibre dall'incubatore in una nuova piastra di Petri di sei centimetri contenente mezzo di coltura di fibroblasti integrato con acido L-ascorbico, acido L-ascorbico 2 fosfato e trasformare il fattore di crescita beta 1 per un massimo di tre settimane nell'incubatore di coltura cellulare. Alla fine dell'incubazione, utilizzare le forceps o trasferire le fibre coltivate in singoli flaconcini a scintillazione e inclinare ogni flaconcino per consentire l'aggiunta di un massimo di cinque millilitri di N-Metil-2-pirrolidone lungo il lato dei flaconcini. Quindi utilizzare una pipetta sierologica per aspirare lentamente l'N-metil-2-pirrolidone da ogni fibra e trasferire le fibre in nuove fiale a scintillazione per una seconda immersione in N-metil-2-pirrolidone fresco.
Dopo la terza immersione, sciacquare i fili della matrice extracellulare risultanti tre volte in acqua deionizzata in modo simile e posizionare un pezzo di gomma siliconica lungo tre pollici e largo un pollice di 1/23 di pollice con uno stampo rettangolare centrale di otto per quattro millimetri su uno scivolo standard al microscopio in vetro da tre pollici per uno. Dopo l'autoclave, posare ogni fibra a matrice extracellulare fianco a fianco nello stampo in silicone da otto per quattro millimetri fino a quando non c'è spazio aperto visibile. Posizionare lo stampo in un tubo conico da 50 millilitri e congelare le fibre a -80 gradi Celsius fino a completa congelamento.
Per la decellularizzazione, incubare lo stampo in solfato di dodecil di sodio all'1% per 24 ore a temperatura ambiente su un rocker con delicata agitazione. Il giorno successivo, sciacquare la matrice extracellulare estratta con tre lavaggi in tre millilitri di PBS per lavaggio e riempire lo stampo con tampone di digestione DNA / RNA appena preparato per un'incubazione di sei ore a quattro gradi Celsius. Al termine della digestione, aspirare la soluzione di digestione e risciacquare lo stampo tre volte in PBS sterile come dimostrato.
Dopo il terzo lavaggio, incubare le impalcature in 10%Penicillina-Streptomicina in PBS a quattro gradi Celsius durante la notte prima di congelare in un tubo conico da 50 millilitri a -80 gradi Celsius per circa un'ora. Quando la rete è completamente congelata, liofilizzare la rete extracellulare decellularizzata durante la notte, o fino a completa asciugatura, e trasferire le impalcature liofilizzate in un contenitore sterile all'interno di una cappa di sicurezza bio e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Qui viene mostrata una sezione trasversale di una membrana in fibra cava di polisolfone fabbricata utilizzando questo protocollo, che mostra strati esterni ed interni di pori simili a dita caratteristici di una membrana asimmetrica.
Dopo la semina e la coltura delle cellule fibroblatrici, il risciacquo N-metil-2-pirrolidone come dimostrato, vengono prodotti fili traslucidi di matrice extracellulare. Le cellule che producono matrici extracellulari rimangono vitali all'interno delle membrane in fibra cava per l'intero periodo di coltura di tre settimane. La matrice estratta ha un aspetto traslucido quando idratata, esibendo un colore bianco etto e un aspetto fibroso con un allineamento longitudinale lordo sull'assemblaggio della rete e sulla litofilizzazione.
Il passo più critico è il processo di dissoluzione delle membrane in fibra cava coltivate nel solvente N-Metil-2-pirrolidone al fine di estrarre la matrice extracellulare. Il materiale prodotto con questo metodo può essere utilizzato per fabbricare impianti di ingegneria tissutale per studiare la riparazione dei tessuti in studi preclitici. L'N-Metil-2-pirrolidone utilizzato in questo protocollo è irritante per la pelle e gli occhi, e quindi si consiglia di maneggiare la sostanza chimica usando guanti in nitrile, occhiali, un camice da laboratorio e gestirla all'interno di un cappuccio dei fumi.
