يسمح هذا البروتوكول بإنتاج خيوط من مصفوفة خارج الخلية من خطوط الخلايا المستزرعة ، مما يسمح بإجراء أبحاث في تفاعلات مصفوفة الخلايا ، وكذلك البحث في إمكانات هذه المواد الحيوية لإصلاح الجروح. هذه الألياف الاصطناعية يمكن تجنب استجابة الجسم الأجنبية الموجهة ضد المواد الاصطناعية، في حين لا يزال الرسم من ذخيرة غنية من تقنيات تصنيع المنسوجات لخلق مجموعة واسعة من الزرع المنسوجة. (إنّها ستُظهر الإجراء ستكون (كاساندرا ريد طالبة دراسات عليا من مختبري
قبل بذر الخلايا، وأتمتة أغشية الألياف المجوفة في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها العلاج مع 50 ملليلتر من الليفي البلازما البقري في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، استخدم مقصًا صغيرًا معقمة لقطع الألياف إلى ستة سنتيمترات أو أقل ، واستخدم حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة قياس 21 لذرة مرة واحدة 10 إلى الخلايا الليفية الخامسة مباشرة إلى لومينا أغشية الألياف المجوفة. ضع ستة ألياف مبذرة في طبق بيتري قطره ستة بوصات، وحضن الألياف المصنفة لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد خمس دقائق، نقل الألياف من الحاضنة إلى طبق جديد من ستة سنتيمترات بيتري يحتوي على ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة تكملها حمض L-الاسكوربيك، L-الأسكوربيك حمض 2 الفوسفات، وتحويل عامل النمو بيتا 1 لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، استخدم ملقط يا نقل الألياف المستزرعة إلى قارورة التلألؤ الفردية، وإمالة كل قارورة للسماح بإضافة ما يصل إلى خمسة ملليلتر من N-Methyl-2-pyrrolidone أسفل جانب القنينات. ثم استخدام ماصة المصلية لpirate ببطء N-ميثيل-2-pyrrolidone من كل الألياف، ونقل الألياف إلى قارورة تلة جديدة للغمر الثاني في الطازجة N-الميثيل-2-بيروليدون.
بعد الغمر الثالث ، شطف المصفوفة خارج الخلية الناتجة عن المواضيع ثلاث مرات في المياه الأيونية بطريقة مماثلة ، ووضع ثلاثة بوصة طويلة ، بوصة واحدة واسعة 1 / 23rd بوصة سميكة قطعة من المطاط السيليكون مع قالب مستطيل مركزي ثمانية في أربعة ملليمترات على معيار ثلاثة في واحد بوصة شريحة المجهر الزجاجي بوصة. بعد autoclaving، وضع كل مصفوفة خارج الخلية الألياف جنبا إلى جنب في قالب السيليكون ثمانية في أربعة ملليمتر حتى لا يكون هناك مساحة مفتوحة مرئية. وضع القالب في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وتجميد الألياف في درجة مئوية سلبية 80 حتى المجمدة تماما.
لفك الخلايا، احتضان القالب في 1٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة على الروك مع التحريض لطيف. في اليوم التالي ، شطف المصفوفة المستخرجة خارج الخلية مع ثلاثة يغسل في ثلاثة ملليلتر من PBS لكل غسل ، وملء القالب مع DNAs الطازجة المعدة / RNAs الهضم العازل لمدة ست ساعات حضانة في أربع درجات مئوية. في نهاية عملية الهضم، الطامح حل الهضم وشطف القالب ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني عقيم كما هو موضح.
بعد الغسيل الثالث، احتضان السقالات في 10٪ بنسيلين-ستريبتوميسين في PBS في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل أن يتجمد في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في درجة مئوية سالبة 80 لمدة ساعة واحدة. عندما تكون الشبكة قد جمدت تماما، lyophilize شبكة خارج الخلية decellularized بين عشية وضحاها، أو حتى تجف تماما، ونقل السقالات مزيل التحلل إلى وعاء معقمة داخل غطاء محرك السيارة السلامة الحيوية وتخزينها في أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. هنا يظهر مقطع عرضي من غشاء الألياف المجوفة polysulfone ملفقة باستخدام هذا البروتوكول، وعرض الطبقات الخارجية والداخلية من المسام مثل الإصبع مميزة من غشاء غير متماثل.
بعد بذر الخلايا الليفية والثقافة، يتم إنتاج N-Methyl-2-pyrrolidone الشطف كما هو موضح، والخيوط شفافة من مصفوفة خارج الخلية. المصفوفة خارج الخلية إنتاج الخلايا لا تزال قابلة للحياة داخل الأغشية الألياف المجوفة طوال فترة ثقافة ثلاثة أسابيع كاملة. المصفوفة المستخرجة لها مظهر شفاف عند ترطيبها ، وتظهر لونًا أبيضًا ومظهرًا ليفيًا مع محاذاة طولية إجمالية عند تجميع الشبكة وتجميل الأطفال.
الخطوة الأكثر أهمية هي عملية حل أغشية الألياف المجوفة المستزرعة في مذيبات N-Methyl-2-pyrrolidone من أجل استخراج المصفوفة خارج الخلية. يمكن استخدام المواد التي تنتجها هذه الطريقة لاصطياد الأنسجة هندسيا يزرع للتحقيق في إصلاح الأنسجة في الدراسات قبل السريرية. N-ميثيل-2-pyrrolidone المستخدمة في هذا البروتوكول هو مصدر تهيج الجلد والعين، وبالتالي فمن المستحسن أن التعامل مع هذه المادة الكيميائية باستخدام قفازات النتريل، نظارات واقية، معطف مختبر، والتعامل معها داخل غطاء الدخان.
