Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in un processo di scoperta di farmaci su come si comporta un farmaco specifico in un organismo vivente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di schermare le grandi dimensioni del campione in modo rapido ed efficiente. Questa tecnica sta già avendo un impatto importante nella scoperta di farmaci consentendo una valutazione altamente quanititativa degli effetti dei candidati alla droga.
Questo metodo fornisce nuove intuizioni meccaniche sull'insorgenza e la progressione di malattie che si piegano male. Inoltre, questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come l'invecchiamento e gli screening genetici. Siamo molto entusiasti di questa opportunità di introdurre nuovi metodi fisici nello spazio della scoperta di farmaci.
Queste dimostrative di questo metodo sono fondamentali in quanto i passaggi di screening richiedono un'elevata familiarità con questa tecnica automatica novo. A dimostrare la procedura sarà Sam Casford, un assistente di ricerca del nostro laboratorio. Prima di iniziare la procedura, aggiungere 2,2 millileter di ciascun composto farmacologico alla concentrazione appropriata a sei piastre di 5-fluorodeossiuridina o FUDR per ceppo di verme, diffondendo attentamente il composto su tutta la superficie della piastra e asciugare le piastre in condizioni sterili.
Mentre le piastre si asciugano, utilizzare 15 millilitri di tampone M9 per lavare i vermi da cinque ricche piastre del fattore di crescita del nematode e trasferire i vermi liberati in un tubo conico per la centrifugazione. Sospendere di nuovo i nematodi in tre millilitri di tampone M9 fresco per quantificare il numero di vermi nello stadio larvale L4 e seminare 700 larve L4 su ciascuna delle sei piastre FUDR secche per ceppo di verme, per composto. Quando tutti i nematodi sono stati seminati, posizionare le piastre contenenti i ceppi per i quali la paralisi è indotta aumentando la temperatura a 24 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno dopo, accendi le luci del palco del tracker di vermi paralleli e pulisci lo stadio di vetro del tracker con il 70% di etanolo. Se non rimangono residui visibili, rimuovere il cappuccio dell'obiettivo e utilizzare uno spolverino d'aria per pulire l'obiettivo di imaging. Verificare che la fotocamera sia collegata e installata correttamente e iniziare a registrare con il software di acquisizione delle immagini.
Regola le impostazioni della fotocamera per registrare 20 fotogrammi al secondo, con i parametri di registrazione mono-16 appropriati. Utilizzare una piastra di petri vuota di nove centimetri per assicurarsi che lo stage sia impostato sull'altezza corretta e regolare lo stage se necessario. In condizioni sterili, aggiungere tre millilitri di soluzione M9 a una piastra di screening della motilità e utilizzare due millilitri di soluzione M9 per lavare un terzo della superficie di due piastre FUDR caricate con nematode dallo stesso gruppo sperimentale nella piastra di vagliatura.
Quindi, posizionare la piastra di screening sul palco del tracker. Usa un singolo worm per mettere a fuoco la fotocamera e iniziare a registrare gli animali. Al termine della registrazione, scartare la piastra di motilità e contrassegnare le piastre FUDR come utilizzate una volta prima di restituirle all'incubatore.
Per analizzare i dati video, aprire l'interfaccia utente grafica del software di analisi dei dati del worm tracker parallelo e utilizzare la funzione di navigazione per caricare il video di interesse. Selezionare una cartella di destinazione di output e verificare che siano impostati da 600 a 1200 fotogrammi per un'analisi di 30 secondi. Inserire un fattore di conversione da 0,029 pixel a millimetri per l'imaging di una piastra di Petri di nove centimetri a piena risoluzione e selezionare l'algorithhm di tracciamento keep dead.
Nella scheda individua parametri impostare le immagini di uso Z su 100, la spaziatura spaziatura Z su 3, i pixel standard su 54, la soglia su 9, l'apertura su 1 e la chiusura a 2. Regolare i parametri di filtro su una dimensione minima di 20, una dimensione massima di 180 e un worm simile a 0,94. Impostate i parametri delle traiettorie di formatura su una distanza massima di 10, una lunghezza minima di 150 e una memoria di 10.
Impostate i parametri di piegatura e velocità su una soglia di soglia di piegatura di 1,8, una piegatura minima di 0 e un fotogramma per stimare la velocità di 150. Sintonizza le statistiche del verme morto su un battito maxmim al minuto di 5 e una velocità massima di 1. Selezionare la cartella di output e selezionare il numero di fotogrammi di output su 50 e la dimensione del carattere su 10.
Utilizzare la funzione di esempio per testare i parametri e generare le immagini di esempio per verificare se i worm sono visibili durante gli otto passaggi di soglia. Avviare quindi la funzione Avvia processo e combinare i singoli risultati per l'intero set di dati per analizzare i file dei risultati del test, salvando i risultati tramite l'esportazione nella funzione TSV. Questo metodo consente la caratterizzazione di fenotipi di nematodi per grandi studi sulla popolazione di vari modelli worm di malattia neurodegenerativa, come la demenza frontotemporale, il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e la sclerosi laterale amiotrofica.
Così come la caratterizzazione degli effetti di potenziali molecole terapeutiche, utilizzando modelli worm del morbo di Parkinson e Alzheimer. L'elevata precisione di queste misurazioni si ottiene aumentando il numero di vermi che possono essere analizzati rispetto ai metodi tradizionali. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo il tempo tra l'aggiunta dei worm alla motilità e l'inizio del tracciamento.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi per integrare i risultati e collegarsi con l'aggregazione proteica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle malattie neurodegenerative e di errata piegamento, come il Parkinson e l'Alzheimer, per esplorare le giuste applicazioni di scoperta. Non dimenticare che lavorare con FUDR può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come indossare guanti di nitrile, devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
