Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca traslizionale, come la relazione tra i biomarcatori circolanti e la prognosi del paziente. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di valutare l'espressione di un pannello di biomarcatori circolanti con una metodologia facile e affidabile con bassa quantità di materiale di input. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dei pazienti oncologici perché potrebbe identificare biomarcatori circolanti utili nel processo decisionale e nel monitoraggio del trattamento dei pazienti.
Inoltre, questo metodo può fornire informazioni sull'analisi dei biomarcatori circolanti. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'analisi dell'espressione del biomarcatore tissutale per la caratterizzazione molecolare della malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di estrazione sono difficili da imparare.
Per iniziare, trasferire 400 microlitri del campione di plasma in un tubo privo di RNasi e a due millilitri. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione di denaturazione al tubo. Aggiungere quattro microlitri di un chiodo nanomolare.
Dopo aver miscelato la soluzione, aggiungere 800 microlitri di fenolo-cloroformio acido. Vortice la soluzione per 60 secondi e centrifuga alla massima velocità per 15 minuti. Successivamente, trasferire il lysate contenuto nella fase acquosa superiore in un tubo pulito, facendo attenzione a non disturbare l'interfase.
Misurare il volume della fase acquosa recuperata e aggiungere 1/3 di volume di etanolo al lysate. Quindi, posizionare una cartuccia di filtro in un nuovo tubo di raccolta. Trasferire fino a 700 microlitri della miscela etanolo-glisato sulla cartuccia del filtro.
Centrifugare la cartuccia del filtro per 30 secondi a 10.000 volte la gravità. Quindi, misurare il volume totale del flusso. Quindi, aggiungere 2/3 del volume di etanolo al filtrato e mescolare bene.
Posizionare una seconda cartuccia filtrante in un nuovo tubo di raccolta. Quindi, trasferire fino a 700 microlitri del campione sulla cartuccia e centrifugare a 10.000 volte la gravità per 30 secondi prima di scartare il flusso. Aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio a microRNA alla cartuccia del filtro e centrifugarla con un tubo di raccolta a 10.000 volte la gravità per 15 secondi.
Scartare il flusso e rimettere la cartuccia del filtro nello stesso tubo. Successivamente, spostare la cartuccia del filtro in un nuovo tubo di raccolta. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di eluizione preriscaldata alla cartuccia.
Centrifugare la cartuccia del filtro a 10.000 volte la gravità per 30 secondi per recuperare i microRNA. Preparare il cocktail mix di reazione di poliadenilazione secondo il protocollo di testo. Trasferire due microlitri del campione in ogni pozzo di una piastra di reazione.
Quindi, aggiungere tre microlitri del cocktail di reazione ad ogni pozzo. Vortice e centrifugare brevemente la piastra per far girare il contenuto. Quindi, posizionare la piastra in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nel protocollo di testo.
Preparare il cocktail mix di reazione di legatura in un tubo di centrifuga. Quindi, aggiungere 10 microlitri del cocktail ad ogni pozzo della piastra di reazione. Quindi, mescolare il contenuto della piastra di reazione su uno shaker a 1.900 giri/min per un minuto, seguito da una breve centrifuga della piastra.
Successivamente, posizionare la piastra di reazione in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nel protocollo di testo. Per eseguire la reazione di trascrizione inversa, preparare la miscela di reazione in un tubo di centrifuga secondo il protocollo di testo. Quindi, aggiungere 15 microlitri del mix ad ogni pozzo della piastra contenente prodotto legante.
Mescolare il contenuto della piastra su uno shaker a 1.900 giri/min per un minuto, seguito da una breve centrifuga della piastra. Quindi, posizionare la piastra in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nel protocollo di testo. Quindi, preparare il mix di reazione miR-Amp e aggiungere 45 microlitri del mix ad ogni pozzo di una nuova piastra di reazione.
Successivamente, aggiungere cinque microlitri del prodotto RT a ciascun pozzo della piastra di reazione. Mescolare la piastra su uno shaker a 1.900 giri/min per un minuto, seguita da una breve centrifuga della piastra. Quindi, posizionare la piastra in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nella tabella uno del protocollo di testo.
In primo luogo, diluire ogni campione di cDNA nel buffer TE. Quindi, preparare il mix di reazione PCR in un tubo di centrifuga. aggiungendo il 10% del volume in eccesso.
Trasferire 19 microlitri della miscela di reazione ad ogni pozzo della piastra. Sigillare la piastra e centrifugarla brevemente. Infine, eseguire il protocollo termico su un sistema RT-PCR, come indicato nella tabella due del protocollo di testo.
Sono state effettuate diluizioni seriali del controllo spike-in per scegliere quale fosse la migliore concentrazione da aggiungere in tutti i campioni di plasma di questa particolare serie di casi. Grazie a questo protocollo, è stato possibile valutare tutti i biomarcatori in ogni singolo paziente, nonché un singolo biomarcatore nella serie di casi complessiva. In questo protocollo, un pannello di miRNA circolanti correlati all'angiogenesi in relazione alla sopravvivenza senza progressione, alla sopravvivenza complessiva e al tasso di risposta oggettivo è stato analizzato in pazienti con cancro colorettale trattati con un regime di chemioterapia.
Confrontando i livelli di espressione del miRNA tra la linea di base e la prima valutazione clinica, è stato osservato un aumento dell'has-miR-155-5p. Questo aumento è stato associato a PFS e sistema operativo più brevi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i passaggi utilizzando fenolo-cloroformio sotto una cappa aspirante. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'isolamento e l'analisi delle proteine circolanti o la codifica degli RNA al fine di rispondere a domande aggiuntive, come la valutazione di un pannello più esaustivo di biomarcatori circolanti.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biopsia liquida per esplorare l'espressione dei biomarcatori circolanti nei pazienti oncologici. Non dimenticare che lavorare con sangue e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come guanti e camice da laboratorio dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
