يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحث الترجمي، مثل العلاقة بين المؤشرات الحيوية المتداولة وتكهن المريض. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في فرصة تقييم التعبير عن لوحة من المؤشرات البيولوجية المتداولة مع منهجية سهلة وموثوقة مع كمية منخفضة من مواد الإدخال. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج مرضى السرطان لأنها يمكن أن تحدد المؤشرات الحيوية المتداولة المفيدة في صنع القرار ومراقبة علاج المرضى.
كما أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تحليل المؤشرات الحيوية المتداولة. ويمكن أيضا أن تطبق على نظم أخرى، مثل تحليل التعبير العلامات الحيوية الأنسجة لتوصيف الجزيئية للمرض. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات الاستخراج.
للبدء، نقل 400 ميكرولترات من عينة البلازما إلى أنبوب RNase خالية من مليلتر. ثم، إضافة 400 ميكرولترات من حل denaturing إلى الأنبوب. إضافة أربعة ميكروليتر من واحد نانومولار ارتفاع في.
بعد خلط الحل، إضافة 800 ميكرولترات من حمض الفينول الكلوروفورم. دوامة الحل لمدة 60 ثانية، والطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، نقل اللوين الوارد في الطور مائي العلوي إلى أنبوب نظيف ، مع الحرص على عدم إزعاج الطور الداخلي.
قياس حجم المرحلة مائي استردادها، وإضافة 1/3 حجم الإيثانول إلى lysate. ثم ضع خرطوشة تصفية في أنبوب جمع جديد. نقل ما يصل إلى 700 ميكرولترات من خليط الإيثانول-lysate إلى خرطوشة التصفية.
الطرد المركزي خرطوشة مرشح لمدة 30 ثانية في 10، 000 مرة الجاذبية. بعد ذلك، قم بقياس الحجم الإجمالي للتدفق. ثم، إضافة 2/3 من حجم الإيثانول إلى الترشيح، ويخلط جيدا.
ضع خرطوشة تصفية ثانية في أنبوب جمع جديد. ثم، نقل ما يصل إلى 700 ميكرولترات من العينة إلى خرطوشة، والطرد المركزي في 10، 000 مرة الجاذبية لمدة 30 ثانية قبل التخلص من تدفق من خلال. إضافة 700 ميكرولترات من محلول غسل ميكرورنا لخراطيش تصفية، والطرد المركزي مع أنبوب جمع في 10، 000 مرة الجاذبية لمدة 15 ثانية.
تجاهل التدفق من خلال، ووضع خرطوشة تصفية مرة أخرى في نفس الأنبوب. بعد ذلك، قم بتحريك خرطوشة التصفية إلى أنبوب تجميع جديد. ثم، إضافة 100 ميكروليترس من محلول elution مسخ مسبقا إلى خرطوشة.
الطرد المركزي خرطوشة مرشح في 10، 000 مرة الجاذبية لمدة 30 ثانية لاسترداد microRNAs. إعداد مزيج التفاعل متعدد الادينيل وفقا للبروتوكول النص. نقل اثنين microliters من العينة إلى كل بئر من لوحة رد فعل.
ثم، إضافة ثلاثة microliters من كوكتيل رد فعل إلى كل بئر. دوامة وطاردة مركزية لوحة لفترة وجيزة لتدور أسفل المحتويات. بعد ذلك، ضع اللوحة في دورة حرارية، واتبع الإجراء المبين في بروتوكول النص.
إعداد مزيج مزيج التفاعل ربط في أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من الكوكتيل إلى كل بئر من لوحة التفاعل. ثم اخلط محتويات لوحة التفاعل على شاكر عند 1،900 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، تليها جهاز طرد مركزي موجز من لوحة.
بعد ذلك، ضع لوحة التفاعل في دورة حرارية، واتبع الإجراء المبين في بروتوكول النص. لتنفيذ رد فعل النسخ العكسي، قم بإعداد مزيج التفاعل في أنبوب الطرد المركزي وفقًا لبروتوكول النص. ثم، إضافة 15 ميكرولترات من المزيج إلى كل بئر من لوحة تحتوي على المنتج الربط.
اخلط محتويات اللوحة على شاكر عند 1،900 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، تليها جهاز طرد مركزي موجز من لوحة. بعد ذلك، ضع اللوحة في دورة حرارية، واتبع الإجراء المبين في بروتوكول النص. ثم، إعداد مزيج رد فعل مير Amp، وإضافة 45 ميكرولترات من المزيج إلى كل بئر من لوحة رد فعل جديدة.
بعد ذلك، إضافة خمسة ميكرولترات من المنتج RT إلى كل بئر من لوحة رد الفعل. اخلطي اللوحة على شاكر عند 1، 900 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، متبوعة بطاردة مركزية قصيرة من اللوحة. ثم ضع اللوحة في دورة حرارية واتبع الإجراء الموضح في جدول واحد من بروتوكول النص.
أولاً، تخفيف كل عينة من عينات cDNA في المخزن المؤقت TE. ثم، إعداد مزيج تفاعل PCR في أنبوب الطرد المركزي. إضافة 10٪ من حجم زائد.
نقل 19 ميكرولترات من مزيج رد فعل إلى كل بئر من لوحة. ختم لوحة، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وأخيراً، قم بتنفيذ البروتوكول الحراري على نظام RT-PCR، كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص.
تم تنفيذ عمليات تخفيف تسلسلي من ارتفاع في السيطرة من أجل اختيار الذي كان أفضل تركيز لإضافة في جميع عينات البلازما من هذه السلسلة حالة معينة. بفضل هذا البروتوكول ، كان من الممكن تقييم جميع المؤشرات الحيوية في كل مريض ، بالإضافة إلى علامة حيوية واحدة في سلسلة الحالات الإجمالية. في هذا البروتوكول، تم تحليل لوحة من الـ miRNAs ذات الصلة بتولد الأوعية الدموية فيما يتعلق بالبقاء الخالي من التقدم، والبقاء على قيد الحياة، ومعدل الاستجابة الموضوعي في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم الذين عولجوا بنظام العلاج الكيميائي.
وبمقارنة مستويات التعبير من ميرنا بين خط الأساس والتقييم السريري الأول، لوحظت زيادة في لديه-miR-155-5p. وارتبطت هذه الزيادة بأقصر PFS وOS. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر تنفيذ الخطوات باستخدام الفينول-كلوروفورم تحت غطاء أبخرة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عزل وتحليل البروتينات المتداولة أو ترميز RNAs من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل تقييم لوحة أكثر شمولا من المؤشرات الحيوية المتداولة.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخزعة السائلة لاستكشاف التعبير عن المؤشرات الحيوية المتداولة في مرضى السرطان. لا تنس أن العمل مع الدم والكواشف الكيميائية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
