Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo come, come l'attività metabolica viene alterata durante il processo di invecchiamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'uso di un segmento corporeo intatto che ha dati che assomigliano molto allo stato naturale e fisiologico rispetto al classico isolamento mitocondriale. A dimostrare la procedura saranno Anuroop e Annika, una studentessa laureata nel mio laboratorio.
Per iniziare il protocollo, accendere la macchina un'ora prima di iniziare l'esperimento in modo che ci sia tempo sufficiente per raggiungere la temperatura desiderata e rimanere stabili. Quindi, nella configurazione del software, in modalità di amministrazione, scegliere la lunghezza della calibrazione della cartuccia e la temperatura desiderata. Quindi, immettere il seguente protocollo:A seconda del progetto sperimentale, aggiungere passaggi di iniezione dalle porte A a D dopo un passaggio di misurazione scelto.
Per verificare la qualità e la determinazione dell'OCR basale, regolare il protocollo per almeno tre cicli di misurazione prima di impostare l'iniezione del primo farmaco tramite la porta A.Pre-calibrare la cartuccia un giorno, o almeno quattro ore prima del test, aggiungendo 1,0 millilitri di calibante a ciascun pozzo, e posizionare la cartuccia del sensore sopra la piastra. Coprire la cartuccia con Parafilm se è prevista l'idratazione per più di 24 ore per evitare l'evaporazione. Conservare la cartuccia a 37 gradi Celsius senza CO2, durante la notte.
Successivamente, assicurarsi che i farmaci sperimentali siano completamente sciolti in mezzo fresco, più il 2,5% di glucosio. Misurare e regolare il pH della soluzione farmacologica al pH del veicolo alla temperatura desiderata. Pipettare la soluzione farmacologica nella porta di iniezione assegnata.
Quindi caricare la cartuccia nella macchina e iniziare la calibrazione. Regolare i supporti preparati al momento più il 2,5% di glucosio al pH desiderato con un HCl normale. Quindi, preparare una ghiacciaia e posizionare una piastra metallica sul ghiaccio.
Aprire il pacchetto di lastre oculari. Immergere le reti nei media di una piastra di Petri di 16 millimetri. Raccogliere una rete con l'insertore e fare in modo che l'inserter si alimenterà accanto al microscopio.
Aggiungere una piccola goccia di supporto alla rete attaccata all'insertore. Quindi, anestetizza le mosche posizionandole su una piastra metallica ghiacciata. Usando le forcep, afferrare l'addome di una mosca e immergerlo nei media in una piastra di Petri al microscopio.
Usando un secondo paio di forcep, rimuovere delicatamente la testa della mosca. Posizionare la testa al centro della rete attaccata all'insertore e verificare che la testa sia immersa nei supporti. Rimuovere il fluido superfluo prima di centrare le teste per evitare di perdere la testa mentre le si posiziona nel pozzo.
Quando ci sono 16 teste in rete, centrale. Utilizzando l'inserter, posizionare la rete nel pozzo. Assicurarsi che le teste siano intrappolate sotto la rete e aggiungere lentamente 700 microlitri di supporti più il 2,5% di glucosio.
Assicurarsi che i pozzi vuoti, utilizzati per lo sfondo, contengano anche una rete con 700 microlitri del tampone più il 2,5% di glucosio. Controllare i pozzi per le bolle d'aria sotto le reti tramite il microscopio. Pipetta delicatamente su e giù utilizzando una pipetta di un millimetro per rimuovere eventuali bolle.
Mantieni le teste centrato per una lettura OCR affidabile. Quindi aggiungere la piastra alla macchina e avviare la misurazione. Alla fine del protocollo, rimuovere la cartuccia.
Verificare visivamente che non vi siano avanzi visibili nelle otturazioni delle porte. Successivamente, scartare la cartuccia e la piastra se le teste non devono essere utilizzate per l'estrazione di proteine. Ricordarsi di guardare l'ossigeno e i livelli di pH, al fine di rilevare eventuali pozzi anomali prima dell'analisi.
Inoltre, è importante scegliere l'appropriato calcolo del tasso di consumo di ossigeno, in base ai livelli di ossigeno. Dopo aver eseguito il protocollo, è stato osservato che i livelli di ossigeno delle teste di mezza età sono diminuiti più velocemente delle giovani teste di mosca. Quando l'intervallo dei livelli di ossigeno è simile tra le condizioni, è meglio utilizzare l'algoritmo AKOS per generare automaticamente il tasso di consumo di ossigeno, o OCR, che rispecchia in modo affidabile i cambiamenti del livello di ossigeno durante una misurazione tra teste giovani e di mezza età.
L'aggiunta di butirato di sodio, o SB, un inibitore del KDAC, cambia transitoriamente la dinamica dei livelli di ossigeno. Mentre i comandi del veicolo mostrano livelli costanti di ossigeno durante la prima e l'ultima zecca, l'aggiunta di SB provoca una notevole e transitoria caduta dei livelli di ossigeno in queste zecche. Poiché il calcolo AKOS considera tutte le zecche e ignora uno stato anossico, genera un OCR fuorviante, come osservato nei livelli OCR non normalizzati basati su AKOS, che mostrano pochi cambiamenti nell'iniezione della porta A.L'algoritmo fisso, che modella più da vicino e assomiglia ai cambiamenti del livello di OCR e ossigeno, rivela un aumento dell'OCR sul trattamento SB.
Quando si tenta questa procedura, è importante lavorare insieme con due persone al fine di garantire un breve periodo di tempo per preparare una singola piastra. Seguendo questa procedura, altri metodi biochimici, come western Blot e spettrometria di massa possono essere eseguiti per rispondere a domande relative ai meccanismi molecolari, ad esempio quelli che moderano le alterazioni metaboliche.
