Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in un'ampia varietà di campi che richiedono l'inattivazione condizionale e transitoria di un gene di interesse esprimendo in modo reversibile una versione negativa dominante di esso. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente solo un'ablazione parziale nell'attività proteica, preservando così un'espressione endogena residua. Anche se qui descriviamo l'inattivazione della condizione della proteina RB, che funziona in un assemblaggio multimerico, questa metodologia può essere applicata anche alle proteine monomeriche.
Umesh Pyakurel, il nostro tecnico di laboratorio e coautore del manoscritto dimostreranno le procedure. Per iniziare, far crescere le cellule NIH3T3, seguendo le specifiche del fornitore, a 37 gradi Celsius con 5%CO2, utilizzando il mezzo di coltura cellulare raccomandato contenente il 10% di siero bovino fetale. Per cotrasfettare le cellule utilizzando vettori pTet-Splice e pCMV-Tet3G, mescolare prima da due a quattro microlitri del reagente di trasfezione a base lipidica per pozzo e un millilitro di DMEM incompleto per pozzo in un tubo da 15 millilitri e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere da due a tre microgrammi di DNA plasmatico per pozzo al mix DMEM di questo reagente di trasfezione. Mescolare e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro della miscela contenente DNA e il reagente di trasfezione in DMEM ad ogni pozzo di piastra a sei pozzetti con cellule NIH3T3.
Dopo tre o quattro ore di incubazione a 37 gradi Celsius con 5%CO2, aggiungere un millilitro di mezzo completo. Quindi, aggiungere 2 microlitri di doxiciclina ad ogni pozzo e contrassegnare la piastra come plus-doxiciclina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.
Per valutare la funzionalità del costrutto TetO-DN-CB-myc6-Rb1 nella promozione della proliferazione cellulare non programmata, coltura cellule HEI-OC1 in DMEM contenenti 10%FBS, in condizioni permissive. Per gli studi sulla proliferazione cellulare, contare le cellule HEI-OC1 utilizzando un contatore di cellule. Piastra 10.000 celle HEI-OC1 per pozzo su una piastra da 96 porri in 200 microlitri di volume ciascuno.
Incubare le cellule durante la notte a 33 gradi Celsius con il 5%CO2. Per indurre l'espressione transgena, aggiungere un microgrammi per millilitro di doxiciclina a un sottoinsieme di cellule HEI-OC1 trasfette. Utilizzare l'altro sottoinsieme etichettato come meno-doxiciclina e le cellule HEI-OC1 non trasfette come controlli e incubare le cellule come 33 gradi Celsius con 10%CO2.
Per valutare la proliferazione cellulare, 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 100 microlitri di soluzione di legatura del colorante 1x da un kit di proliferazione cellulare a ciascun pozzo della micro-piastra. Seguire il protocollo del produttore e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Utilizzare un lettore di micropiacplate a fluorescenza per misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun campione.
Per valutare ulteriormente la proliferazione cellulare utilizzando l'immunocitochimica, placcare le cellule HEI-OC1 su un vetro di copertura posto in ogni pozzo di una piastra da 12 porri in DMEM. Incubare le cellule durante la notte a 33 gradi Celsius. Il giorno seguente, cotrasfetto alle cellule in due pozzi con i vettori pTet-Splice e pCMV-Tet3G, quindi eseguire il trattamento della doxiciclina su un bene come fatto con le cellule NIH3T3.
Utilizzare un controllo non trasfetto e un controllo. Per elaborare le celle per l'etichettatura Ki-67, fissarle con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavarli tre volte con PBS ghiacciato per cinque minuti ciascuno.
Aggiungere lo 0,25% di detersivo non ionico in PBS e incubare per 10 minuti. Ripetere il lavaggio tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno. Utilizzare il siero al 10% per bloccare le celle.
In una camera umidificata per un'ora a temperatura ambiente. Aggiungere 500 microlitri di anticorpo primario Ki-67 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare di nuovo le cellule tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna.
Aggiungere un millilitro dell'anticorpo secondario e incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale secondaria, lavare nuovamente le cellule tre volte per cinque minuti in PBS al buio. Per etichettare le cellule HEI-OC1 con phalloidin, incubarle in 1:200 phalloidin per 30 minuti a temperatura ambiente.
Per etichettare i nuclei cellulari, incubare le cellule con cinque microgrammi per millilitro di DAPI Per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la consegna dei topi transgeni, genotipo i cuccioli utilizzando un set primer specifico per la regione di fusione CBRb1 come descritto nel manoscritto. Allevare topi adulti TetO-DN-CB-myc6-Rb1 alla linea di induttori ROSA-CAG-rtTA e tetreciclina per generare topi DN-CBRb sperimentali e genotipare la loro prole come descritto nel manoscritto.
NIH3T3 non esprime proteine RB1 endogene, quindi la robusta espressione RB1 vista qui è dovuta all'induzione transgena in presenza di Dox, ma non in sua assenza, confermando l'efficiente attivazione del costrutto RB1 del mix TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Al contrario, le cellule HEK293 hanno espressione RB1 endogena. L'aggiunta di doxiciclina ha portato all'attivazione di TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e alla down-regulation RB1.
L'espressione RB1 è stata ripresa 21 ore dopo la rimozione della doxiciclina dal supporto. Le cellule HEI-OC1 cotrasfette con gli stessi vettori, mostravano un modesto ma significativo aumento del numero di cellule che seguono il trattamento della doxiciclina rispetto alle cellule trasfette non trattate con doxiciclina e alle cellule non trasfette. L'ibridazione fluorescente in situ ha confermato l'inserimento genomico del transgene TetO-DN-CB-myc6-RB1 nei topi.
C'è stato un aumento iniziale dell'espressione totale della proteina RB1 in cocllea dei topi transgenici trattati con doxiciclina per tre giorni rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, nei gruppi trattati con doxociclina per sette e 10 giorni, è stata osservata una significativa riduzione dell'espressione di RB1. Indipendentemente dal tessuto analizzato, è stata osservata una significativa riduzione della proteina RB1 nei topi transgenici trattati con doxociclina, ma non nel gruppo di controllo, confermando l'efficienza del costrutto TetO-DN-CB-myc6-RB1.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante verificare che ciascuno degli elementi di codifica del transgene sia in frame tra loro. Se le regioni codificanti di Cathepsin B e del retinoblastoma descritte in questo rapporto fossero, per caso, collegate fuori dal fotogramma, non produrrebbe la proteina di fusione prevista. Pertanto, la verifica della sequenza del DNA deve essere effettuata prima di iniettare il transgene in embrioni di topo uni-cellula.
Seguendo questa procedura, l'onnipresente promotore CAG può essere sostituito con promotori specifici al fine di studiare la funzione genica in modo specifico di una cellula.
