Name: protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants
Uploaded: 2018-09-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants at JoVE.com

Quest'opera è stata sostenuta dai finanziamenti in-House di USDA.

1. preparazione
<ol><li>Raccogliere le attrezzature, materiali e software per registrare ed elaborare il video dell'impianto di congelamento.<ol>
<li>Avviare un congelatore programmabile impostando l'interruttore di accensione su One impostare la temperatura a 0 ° C. Programma il congelatore per raggiungere-8 ° C a 1 ° C/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare una pianta della fragola 6 settimane-vecchio con 2-5 fiori che è stato coltivato in un contenitore da 1L nel congelatore.</li>
	<li>Impostare 2 telecamere IR (ad es., telecamere FLIR T620) utilizzando cinghie di fissaggio e un piccolo blocco di legno per produrre l'angolo di convergenza corretta delle lenti. Nota: La distanza ottimale per il centro delle lenti di 2 macchine fotografiche dello spazio è generalmente considerata essere lo stesso come la distanza tra gli occhi1 o circa 7 cm.</li>
	<li>Montaggio sia su un 10 x 10 cm laboratorio jack e posizione abbastanza alla pianta per consentire l'immagine da mettere a fuoco vicino il jack nel congelatore. Regolare le telecamere verticalmente e orizzontalmente affinché la stessa parte della pianta è visibile da entrambe le fotocamere. Utilizzare il jack per posizionare entrambe le fotocamere in verticale in modo che le 2 immagini contengono il di piante intere e una parte del terreno.</li>
	<li>Collegare le 2 telecamere utilizzando un connettore USB per le prese USB sul computer.</li>
	<li>Inserire le 2 uscite di a/c in entrambe le fotocamere per consentire il monitoraggio continuo delle piante.</li>
</ol>2. computer e l'installazione di Software per la registrazione
<ol><li>Aprire 2 finestre (1 per ogni telecamera) del software facendo doppio clic sull'icona per il software della telecamera IR 2 x. Seguire le istruzioni nel menu aiuto per collegare la telecamera a sinistra nella finestra di sinistra e la telecamera a destra nella finestra di destra. Nota: I dettagli per l'utilizzo del software possono essere letta attraverso il menu aiuto. Una tavolozza monocromatica è più adatta per questo esempio a causa della necessità di utilizzo di colorazione rosso-blu per il rendering 3D.</li>
	<li>Aprire il software di cattura schermo facendo doppio clic sull'icona per il programma. Regolare il fotogramma acquisito facendo clic e trascinando il telaio in modo che include entrambe le fotocamere per consentire una cattura dello schermo di entrambe le telecamere contemporaneamente. Nota: Schermata di cattura il flusso video da entrambe le telecamere contemporaneamente è fondamentale perché permette una sincronizzazione perfetta di visite sia a sinistra che a destra.</li>
	<li>Registrare i video con incrementi di 3 h per un'elaborazione più facile del software di elaborazione video. Nota: È impossibile sapere esattamente quando la pianta si blocca, quindi è importante a record per qualche tempo prima dell'evento di congelare. La possibilità di registrare in segmenti è una caratteristica di questo software, quindi è consigliabile che questa viene impostata per registrare per 3 h. Il software verrà automaticamente salvare la registrazione di 3 h e poi iniziare una nuova registrazione. Il file per ogni 3-ore di registrazione verrà assegnato automaticamente una sequenza numerica dopo il nome. Ogni file video sarà da 10 a 20 GB, quindi assicurarsi che spazio sufficiente sia disponibile su un disco rigido per più file di queste dimensioni.</li>
	<li>Avviare il programma di congelatore selezionando Esegui nel menu controller e iniziare la cattura dello schermo. Quindi premere il tasto Rec sulla finestra. Assicurarsi che la struttura Mostra la regione dello schermo viene catturato diventa rossa.</li>
	<li>Registrare la pianta di fragola congelamento fino a-8 ° C e tenere la temperatura del freezer per 1 h.</li>
	<li>Alzare la temperatura del congelatore a 2 ° C/h fino a quando il congelatore è a + 2 ° C. Interrompere la registrazione. Nota: Il totale tempo di congelamento è 14 h.</li>
	<li>Convertire i file di interesse da formato. MP4 in. MOV utilizzando un software di conversione di file. Nota: In questo caso, un file di singolo 3h contenenti 1 o più eventi di blocco verrà utilizzato.</li>
</ol>3. elaborazione Video utilizzando un Video Software di Imaging
Nota: Video software di imaging sarà utilizzato in questo esempio. Tutorial su come utilizzare il software sono disponibili online. Questo esempio presuppone una conoscenza di base del software. La comprensione di termini come "composizione", "strato" e "coda di rendering", così come i vari pannelli e come modificarli, è presupposto.
<ol><li>Fare doppio clic in un punto qualsiasi all'interno del pannello progetto per importare il file. MOV di interesse nel software di imaging e trascinare il file sull'icona di composizione nella parte inferiore del pannello progetto. Quindi salvare il progetto nella stessa cartella che contiene il video originale. Nota: Il video registrato sarà visibile nel riquadro di anteprima.</li>
	<li>Fare clic sull'icona Area di interesse lungo la parte inferiore della finestra di anteprima e, utilizzando il cursore, delineare solo la registrazione dalla videocamera sinistra.</li>
	<li>Trascinare l'icona di composizione per creare una seconda composizione dello stesso video lo stesso video. MOV. Ripetere il punto 3.3, ma questa volta, è possibile utilizzare il cursore per selezionare solo la fotocamera giusta.</li>
	<li>Selezionare composizione > Ritaglia Comp per area di interesse per la vista di sinistra. Ripetere questa operazione per la vista giusta. Rinominare ogni composizione per indicare che è destra e sinistra.</li>
	<li>Evidenziare la composizione sinistra facendo clic su di esso e, nel menu principale in alto, selezionando composizione > Aggiungi a coda di rendering.</li>
	<li>Nella coda di rendering, fare clic su Modulo di Output e assicurarsi che il video verrà visualizzato come un video (ad esempio, un video di QuickTime). Fare clic sulle Impostazioni di rendering per ridurre la risoluzione per consentire un rendering più veloce. Fare clic su Output, nome dei video Sinistra di fragolae salvarlo nella stessa cartella come la registrazione originale e il progetto. Fare clic su Salvae quindi fare clic sul pulsante Render al lato superiore destro del pannello render.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.6 per la composizione di Destra di fragola .</li>
	<li>Fare doppio clic sul pannello progetto e importare i video di destra e Sinistra di fragola Fragola che sono stati appena resi.</li>
	<li>Evidenziare entrambi i video e trascinarli sull'icona di composizione nella parte inferiore del pannello progetto. Nella schermata pop-up chiedendo per la Durata fissa, immettere 3 con 5 zeri per una durata di 3 h. Nota: Entrambi i video, precisamente sincronizzati, sarà nel pannello progetto, ma solo il video più in alto nel pannello Composizione sarà visibile.</li>
	<li>Per visualizzare l'altra immagine, fare clic sul piccolo bulbo oculare per disattivare i layer. Premere CTRL/W per permettere un controllo rotazione delle immagini nel pannello anteprima utilizzando il cursore. Utilizzando il cursore e cliccando lo strato superiore e spegnere, regolare l'aspetto rotazione della parte superiore o la vista dal basso per assicurarsi che entrambe le immagini sono sullo stesso piano di rotazione. Quindi regolare la X - e Y-aereo direttamente all'interno della subroutine di occhiali 3D.</li>
	<li>Evidenziare lo strato superiore del pannello Composizione e scegliete effetto > prospettiva > occhiali 3D dal menu nella parte superiore. Nota: I parametri per il 3D occhiali effetto pop-up all'interno del pannello di controllo.</li>
	<li>Nel pannello di controllo, fare clic sulla casella a destra della "vista sinistra" — Se il pannello di controllo non è separato dal pannello progetto, fare clic sulla scheda Pannello di controllo nella parte superiore del pannello progetto. Elenco i 2 video nel pannello Composizione in un menu a discesa, evidenziare il video nell'elenco per la "vista sinistra". Ripetere questo passaggio per "vista destra".</li>
	<li>Nella casella a destra della vista 3D, selezionare Rosso blu LR.</li>
	<li>Utilizzando occhiali rosso-blu, ispezionare la visualizzazione nel pannello progetto. Se la vista 3D sembra essere corretto, prova a cliccare Scambia sinistra-destra. Regolare la convergenza di scena e allineamento verticale per eliminare qualsiasi ceppo ghosting e occhio.</li>
	<li>Quando l'aspetto 3D del video è accettabile, evidenziare la composizione facendo clic su di esso e selezionare composizione > Aggiungi a coda di rendering come è stato fatto nel passaggio 3,7. Il rendering del video nella stessa cartella degli altri file nel progetto. Nota: Questo file sarà piuttosto grande. Una volta che il file è stato reso, può essere nuovamente eseguito il rendering di file di dimensioni ridotte utilizzando il software di elaborazione video.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+display+technologies.">Three-dimensional display technologies.</a> Advances in Optics and Photonics. 5, 456-535 (2013).</li><li>Ceccardi, T. L., Heath, R. L., Ting, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+exotherm+measurement+using+infrared+thermography.">Low-temperature exotherm measurement using infrared thermography.</a> HortScience. 30, 140-142 (1995).</li><li>Wimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> History of thermal imaging, Security Sales and Integration. , (2011).</li><li>Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+ice+nucleation+and+propagation+in+plants+using+infrared+video+thermography.">Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography.</a> Plant Physiology. 113, 327-334 (1997).</li><li>Kuprian, E., Tuong, T., Pfaller, K., Livingston, D. P., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+supercooling+of+reproductive+shoots+is+enabled+by+structural+ice+barriers+being+active+despite+an+intact+xylem+connection.">Persistent supercooling of reproductive shoots is enabled by structural ice barriers being active despite an intact xylem connection.</a> Public Library of Science ONE. 11, e0163160 (2016).</li><li>Livingston, D. P., Tuong, T. D., Murphy, J. P., Gusta, L., Wisniewski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+infrared+thermography+of+ice+nucleation+and+propagation+in+wheat+under+natural+frost+conditions+and+controlled+freezing.">High-definition infrared thermography of ice nucleation and propagation in wheat under natural frost conditions and controlled freezing.</a> Planta. 247, 791-806 (2017).</li><li>Boyles, R. P., Raman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+climate+patterns+and+trends+in+North+Carolina+(1949-1998).">Analysis of climate patterns and trends in North Carolina (1949-1998).</a> Environment International. 29 (2-3), 263-275 (2003).</li><li>Poling, E. B., Poling, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+Cold+Events.">Managing Cold Events.</a> A Growers' Guide to Production, Economics and Marketing. , 75-97 (2015).</li><li>Hacker, J., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+porpagaion+in+plants+visualized+at+the+tissue+level+by+infrared+differential+thermal+analysis+(IDTA).">Ice porpagaion in plants visualized at the tissue level by infrared differential thermal analysis (IDTA).</a> Tree Physiology. 27, 1661-1670 (2007).</li><li>He, J. Q., Harrison, R. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+imaging+system+for+strawberry+phenotyping.">A novel 3D imaging system for strawberry phenotyping.</a> Plant Methods. 13, 93-101 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Due telecamere IR sono necessari per questo protocollo, ed essi devono essere rivolti verso il soggetto da angolazioni leggermente diverse1. Ciò richiederà le lenti per essere da 5-8 cm tra loro, ma entrambi devono essere finalizzati allo stesso posto al soggetto di essere filmata. Le lenti della fotocamera da 2 può essere considerato una sorta di surrogato per gli occhi dello spettatore. La telecamera a sinistra è analoga all'occhio sinistro e la fotocamera giusta per l'occhio destro. Il soft...

Pur vivendo in un mondo delle tre dimensioni fisiche, i ricercatori sono spesso limitati a riferire le osservazioni visive in 2D. Anche se immagini 2D sono generalmente sufficienti per comunicare informazioni importanti, questa mancanza di informazioni sulla profondità limita la nostra capacità di percepire e comprendere la complessità di oggetti del mondo reale. 1
Questa carenza di informazioni sulla profondità fornito un incentivo a produrre video 3D principalmente nell'industria cinematografica commerciale dal primi anni del 19001. Tuttavia, generando informazioni 3D in immagini fisse e video è ostacolata dalle complessità coinvolte nella produzione di tali immagini. L'approccio più semplice per la generazione di film in 3D si basa su principi utilizzati nella fotografia stereoscopica. Fotografia stereoscopica utilizza due immagini dello stesso oggetto da punti di vista leggermente diversi che trasmette un'immagine 3D nel cervello. Per rendere questo possibile, ogni occhio deve guardare solo alla sua rispettiva immagine (cioè, l'occhio sinistro l'immagine di sinistra e l'occhio destro l'immagine di destra). Dal momento che gli occhi non lo farà naturalmente, copricapo stereoscopico è stato progettato per rendere questo possibile1. Diversi stereoscopico visualizzato tecniche, anche come polarizzazione interlacciata, tempo-multiplex e tecniche di esposizione testa-supporto, sono state utilizzate durante lo sviluppo di film in 3D, ma il metodo di colore-intreccio o anaglifi utilizzando rosso e verde (o ciano) occhiali è una delle tecniche più semplici e meno costose. Per una rassegna completa di imaging 3D e le varie tecniche coinvolte, vedere la recensione di Geng1.
Monitoraggio di congelamento in piante mediante termografia IR si basa sul principio che quando l'acqua congela, deve abbandonare energia interna2. Questa energia è sotto forma di calore, che è rilevabile nella regione IR dello spettro elettromagnetico. Telecamere in grado di registrare l'energia IR sono stati in uso dal 19293. È il primo rapporto pubblicato utilizzando la tecnologia IR alla pellicola di congelamento in piante da Cecardi et al. 2, ma la risoluzione della fotocamera utilizzata rende difficile determinare con precisione il tessuto dove è iniziato il congelamento. Wisniewski et al. 4 determinato più precisi siti di nucleazione di ghiaccio in diverse specie di piante utilizzando una fotocamera a risoluzione più elevata. Come la tecnologia utilizzata in termografia IR migliorata, immagini ad alta risoluzione ha portato a scoperte come ostacoli al congelamento5 e la precisa localizzazione cellulare di ghiaccio formazione6.
Una difficoltà a riprese di soggetti in IR è causata da piccole differenze di temperature. In questo modo la maggior parte degli oggetti nel campo visivo di un colore simile, che lo rende difficile determinare con precisione quali oggetti sono congelamento. Questo può essere importante quando per determinare l'ordine di congelamento in tessuti specifici, come foglie o radici nel grano6. Se il video di IR di piante di congelamento potrebbe essere imaged in 3D, potrebbe essere migliorata la precisione di determinare quale parte della pianta è gelida a un certo punto nel tempo.
Fragola è una coltura in alcune zone degli Stati Uniti in cui le temperature di congelamento sono di notevole preoccupazione per i coltivatori. In alcune condizioni di coltivazione, è comune per i fiori della fragola a comparire congelare 2-3 settimane prima della media la scorsa primavera. Un evento di blocco può verificarsi più tardi giugno in alcune zone dei Monti Appalachi7 e solitamente risultati nella morte del fiore. Protezione antigelo è, pertanto, fondamentale per congelare i coltivatori di fragole in aree soggette a questi eventi. Fragola coltivatori in Carolina del Nord, ad esempio, gelo-devono proteggere, in media, tra 4-6 eventi di gelo prima della fioritura e si blocca dura 1-2 durante la prima fioritura periodo8. Per aiutare a sviluppare fragola genotipi che sono più tolleranti di congelamento, è importante capire i vari aspetti del congelamento, come ad esempio i siti di ghiaccio nucleazione e propagazione in altre parti della pianta. Termografia IR offre un mezzo efficace per affrontare questi problemi.
Qui, usiamo fragola per illustrare una tecnica per la registrazione di eventi congelamento in 3D utilizzando il metodo di anaglifi. Fragola è adatto per questo esempio, perché le foglie e i fiori sono ampiamente distribuiti nello spazio 3D e possono essere difficili da differenziare quando hanno visto in video 2D a infrarossi.

<table><tbody><tr><td>T620 Infrared Camera and software</td><td>FLIR</td><td>55903-5122</td><td>2 cameras are needed. Software works only on a Windows-based computer</td></tr><tr><td>After Effects</td><td>Adobe</td><td>15.0.1.73</td><td>Post-Production Video Editing Software</td></tr><tr><td>Bandicam</td><td>Bandisoft</td><td>4.1.2.1385</td><td>Screen Capture Software</td></tr><tr><td>Laboratory Scissor Jack&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Eisco</td><td>CH0642A</td><td>Steel Platform 13X15 cm</td></tr><tr><td>Fastening Strap</td><td>Velcro</td><td>90441</td><td>To hold camera on jack.&amp;nbsp; Should be at least 60cm long by 2cm wide</td></tr><tr><td>Media Converter</td><td>iSkysoft</td><td>10.0.6</td><td>Software to convert mp4 files to .mov&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants

Congelamento in piante possa essere monitorato utilizzando termografia ad infrarossi (IR), perché quando l'acqua congela, emana calore. Tuttavia, problemi con contrasto di colore fanno 2-dimensioni immagini a infrarossi (2D) un po' difficile da interpretare. Visualizzazione di un'immagine IR o il video di piante congelamento in 3 dimensioni (3D) consentirebbe una più accurata identificazione dei siti di nucleazione di ghiaccio nonché la progressione di congelamento. In questa carta, dimostriamo un mezzo relativamente semplice per produrre un video 3D a infrarossi di una pianta di fragola di congelamento. Fragola è una coltura economicamente importante cui è sottoposto un inaspettato primavera congelare eventi in molte aree del mondo. Una comprensione accurata del congelamento in fragola fornirà sia gli allevatori e i coltivatori con modi più economici per evitare danneggiamenti agli impianti durante condizioni di gelo.
La tecnica prevede un posizionamento di due telecamere IR ad angolature leggermente differenti per filmare la fragola di congelamento. I due flussi video verranno sincronizzati con precisione utilizzando un software di cattura schermo che registra contemporaneamente entrambe le fotocamere. Le registrazioni verranno quindi importate nel software di imaging e trattati con una tecnica di anaglifi. Utilizzando occhiali rosso-blu, il video 3D renderà più facile per determinare il sito preciso di nucleazione di ghiaccio sulle superfici di foglia.

Sorprendentemente, il video di IR della pianta della fragola congelamento (Supplemental Video 1) indicato che non tutti i fiori/foglie congelato allo stesso tempo. Le foglie e i fiori congelato singolarmente a temperature diverse, ma le foglie si è bloccato prima che i fiori e ad una temperatura superiore. Inoltre, il congelamento ha cominciato nelle foglie, ma non necessariamente nella stessa posizione su ogni foglia. Mentre questi risultati non sono stati descritti pre...

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Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Qui, presentiamo un protocollo per una pianta di fragola congelamento in 3 dimensioni di immagine. Due telecamere ad infrarossi posizionate ad angolature leggermente differenti sono utilizzati per produrre un video anaglifi rosso-blu per osservare il congelamento dell'impianto in 3 dimensioni.

Protocollo per la produzione di Video tridimensionale a raggi infrarossi di congelamento in piante

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

protocol-for-producing-three-dimensional-infrared-video-freezing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

6.1K Views.  United States Department of Agriculture and North Carolina State University. Qui, presentiamo un protocollo per una pianta di fragola congelamento in 3 dimensioni di immagine. Due telecamere ad infrarossi posizionate ad angolature leggermente differenti sono utilizzati per produrre un video anaglifi rosso-blu per osservare il congelamento dell'impianto in 3 dimensioni.

Video: Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

L&#39;uso di ad alta risoluzione termografia a infrarossi (HRIT) per lo studio di ghiaccio nucleazione del ghiaccio e propagazione nelle piante

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Ricerca

Ambiente

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biologia

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Clearing ottico dei tessuti vegetali per l'imaging a fluorescenza

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Protocollo per la produzione di Video tridimensionale a raggi infrarossi di congelamento in piante

Riepilogo

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Un metodo semplice per l'imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

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Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Misurazione spaziale e temporale Ca

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia

Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus

Clearing ottico dei tessuti vegetali per l'imaging a fluorescenza