Questo metodo può essere utile nell'imaging dell'intera pianta per rivelare la morfologia intatta, i processi di sviluppo e le interazioni pianta-microbo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo osservare direttamente l'interno di un corpo vegetale senza infliggere danni su di esso. Poiché questo metodo si applica a una vasta gamma di specie e tessuti vegetali, può aiutare ad accelerare la scoperta di nuovi fenomeni nella ricerca biologica vegetale.
La fissazione è un passaggio critico in questa procedura. Prima della fase di compensazione, è necessario controllare l'intensità della proteina fluorescente dopo la fissazione. Per iniziare a immergere i campioni di piante nella soluzione fissativa in un microtubo e assicurarsi che il volume della soluzione fissativa sia superiore a cinque volte il volume del campione.
Sigillare il micro tubo con un parafilm e praticare dei fori usando un ago. Posizionare il microtubo in un essiccatore e regolare lentamente il grado di vuoto a circa 690 millimetri di mercurio in modo che le bolle appaiano gradualmente dai campioni. Spegnere la pompa per vuoto dopo aver evacuato l'essiccatore.
Sfiatare l'essiccato con attenzione senza disturbare i campioni. Accendere nuovamente la pompa per vuoto e spegnerla dopo aver evacuato l'essiccatore. Aprire l'essiccatore con attenzione senza urtare la soluzione fissativa nel microtubo.
Rimuovere la soluzione fissativa e aggiungere 1x PBS con una micro pipetta. Dopo aver conservato per un minuto, sostituire il vecchio PBS con il nuovo PBS 1x. Dopo aver rimosso PBS a cinque volte il volume del campione della soluzione di compensazione, sigillare il microtubo con parafilm e praticare dei fori con un ago.
Posizionare i campioni nell'essiccatore. Evacuare e spegnere la pompa per vuoto. Aprire delicatamente l'essiccatore, quindi chiudere il microtubo.
Invertire il micro tubo, ogni uno o due giorni per accelerare il processo di compensazione. Per il telaio distanziatore, tagliare un foglio di gomma siliconica con una lama di rasoio regolando lo spessore del foglio di gomma siliconica in base allo spessore del campione. Posizionare il telaio in silicone su un vetro di copertura, quindi posizionare i campioni trattati all'interno del telaio e aggiungere circa 100 microlitri di soluzione di compensazione per rimuovere eventuali bolle.
Coprire con un altro vetro di copertura per evitare l'evaporazione della soluzione di compensazione. Osservare i campioni al microscopio fluorescente. Dopo l'osservazione restituire i campioni alla soluzione di compensazione in un microtubo.
Foglie fisse di varie specie sono state incubate in PBS o ClearSee per otto giorni, in ClearSee o ClearSeeAlpha per due giorni. ClearSee può eliminare foglie di varie specie. Dopo aver estratto la cuticolare, ClearSee potrebbe eliminare le foglie di riso.
Poiché il componente solfito di sodio in ClearSeeAlpha previene l'ossidazione dei polifenoli a causa dell'effetto riducente, ClearSeeAlpha potrebbe eliminare i pistilli di tabacco e tirania senza alcuna pigmentazione marrone. Le foglie di Ubiquitina-10 promotore H2B-mClover di arabidopsis thaliana sono state trattate con PBS o ClearSee per tre giorni. Il trattamento ClearSee ha ridotto il colore verde pallido della foglia arabidopsis H2B-mClover e migliora l'intensità di fluorescenza di H2B-mClover rispetto all'incubazione PBS.
Le foglie trattate con ClearSee sono state osservate mediante microscopia a eccitazione a due fotoni con eccitazione a 950 nanometri. La parete cellulare è macchiata di calcaflour-bianco. I nuclei sono etichettati con il promotore dell'ubiquitina-10, H2B-mClover.
Le immagini Y Z e X Z sono sezioni trasversali nella posizione indicata dalle linee tratteggiate bianche. La preparazione della soluzione fissativa è importante per fissare i campioni. Tuttavia, è necessario prestare attenzione per evitare danni ai campioni sotto vuoto.
L'imaging microscopico può essere eseguito per studiare più modelli di espressione genica e comunicazioni intracellulari durante lo sviluppo e l'infezione delle piante seguendo questa procedura.
