Gli autori vorrei ringraziare Heather Currey per il suo contributo iniziale per lo studio di progettazione e Dr. Swarup Mitra per la sua revisione critica del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Michael B. Harris per commenti, perfezionamenti e assistenza nella produzione la dimostrazione di questa metodologia. I ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numeri UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 e di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) da il National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero 5P20GM103395-15. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. UA è un datore di lavoro AA/EO e istituzione educativa e vieta la discriminazione illegale contro qualsiasi individuo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis setaccio costruzione e uso
<ol><li>
Protocollo di costruzione
	<ol>
<li>Acquisire 2 coperchi da provette coniche da 50 mL (Figura 1A).</li>
		<li>Rimuovere l'area di centro all'interno del labbro interno dei coperchi (quando hanno visto dal basso, Figura 1B) utilizzando un bruciatore di Bunsen e una sonda di metallo caldo o un saldatore o ha fatto un passo trapano. Nota: Utilizza il calore per tagliare il coperchio di plastica è preferibile una lama perché c'è meno rischio di lesioni.</li>
		<li>Pulire e carteggiare i bordi tagliati e la superficie con una lima curva o un rotary rettifica strumento (ad es., Dremel) superiore. Vedere Figura 1.</li>
		<li>Tagliare il cerchio del monofilo al diametro appropriato (Figura 1). Per questo, tracciare un coperchio su uno strato di maglia di nylon monofilamento e tagliare appena dentro la linea tracciata.</li>
		<li>Tagliare le scanalature/barre la superficie superiore dei coperchi per migliorare l'adesione dei due coperchi quando la colla è applicata alla plastica (Figura 1E).</li>
		<li>Pulire i coperchi con etanolo e lasciarli asciugare.</li>
		<li>Applicare la colla cianoacrilato per la superficie superiore di entrambi i coperchi, mantenendo verso il bordo esterno. Nota: un po' di colla va un lungo cammino.</li>
		<li>Posare il monofilo, secondo la tabella 1, su un coperchio incollato (Figura 1F). Posizionare il secondo coperchio rovesciato sopra la maglia; entrambi i coperchi devono avere loro cime insieme. Premere saldamente insieme (Figura 1). Assicurarsi che la rete sia tesa. Nota: come misura di sicurezza, uso delle pinzette per posizionare la mesh sui coperchi.</li>
		<li>Una volta che il primo strato di colla si è asciugata, applicare un anello della colla del cianoacrilato intorno allo spacco esterno tra i coperchi. Essere generosi come questo aggiunge l'integrità e impedisce qualsiasi peeling apart o con perdite.</li>
		<li>Etichettare il filtro con la maglia dei pori del monofilo. Nota: Qui, usiamo due maglie poro — 20 µm e 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizzare il protocollo
	<ol>
<li>Pre-bagnato il setaccio.<ol>
<li>Dispensare una soluzione salina, come M9 [5 g di NaCl, 6 g di Na2HPO4, 3 g di KH2PO4, 1 L di ultrapura H2O e 1 mL di MgSO4 (1m)]17, attraverso il centro del setaccio sino ad ottenere una gocciolina , si condensa e gocciola fuori dal centro della parte inferiore del filtro (Figura 2A). Facoltativamente, applicare un panno privo di lanugine (ad es., Kimwipe) verso il basso per forma o diffondere una gocciolina di umidità sulla mesh.</li>
			<li>Posizionare il setaccio sopra una provetta conica da 50 mL. Etichettare la provetta come 'Tubo di rifiuti' (Figura 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavare una popolazione di c. elegans fuori una piastra di agar.<ol>
<li>Lavare la piastra con il buffer di M9 e posizionare il mezzo verme-contenente sulla fesa di monofilo 1 mL alla volta (Figura 2). Assicurarsi di operare nel centro della maglia. Lavare tutti i vermi dalla piastra. Nota: In genere, 3 mL di M9 per un piatto di 60 mm è sufficiente.</li>
			<li>Per ridurre al minimo il numero di vermi perdita nel pipettaggio, utilizzare un pipetta Pasteur di vetro per spostare i vermi fuori la piastra e al centro della maglia (ripetere se necessario).</li>
			<li>Risciacquare il filtro con il buffer di M9 dall'alto. Ancora una volta, assicurarsi di operare nel centro della maglia e sciacquare tutti i vermi in quella zona. Lavare tante volte quanto necessario per garantire che tutti i batteri e i più piccoli vermi sono passati attraverso le maglie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere gli animali di pari dimensioni dal setaccio.<ol>
<li>Allegare una nuova provetta conica 50 mL alla parte superiore della sieve, con i vermi adulti dal passaggio 1.2.2.3 rivolto verso l'interno del nuovo tubo di raccolta (Figura 2D).</li>
			<li>Rimuovere il primo tubo (tubo di scarico) e capovolgere velocemente il setaccio e il nuovo tubo per mantenere la goccia dalla migrazione (Figura 2E). Nota: Se la sterilità non è necessaria, utilizzare un panno privo di lanugine (ad es., Kimwipe) per stoppino fluido dal basso della maglia prima del capovolgimento.</li>
			<li>Sciacquare la mesh con M9 nel nuovo tubo 50 mL da nuovo fesa (Figura 2F). Ancora una volta, operare nel centro della maglia e mantenere una goccia sulla parte inferiore della maglia.</li>
			<li>Consentire i vermi di estinguere o li spin delicatamente verso il basso (ad esempio, < 16 x g) per circa 1 min (Figura 2).</li>
			<li>Aspirare la soluzione tampone dal pellet di vermi, idealmente verso il basso per > 0,5 mL, o rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare il pellet.</li>
			<li>Pipettare i vermi usando un vetro pipetta Pasteur su un piatto NGM e lasciarli asciugare. Spazio più goccioline fuori su un piatto nuovo modo si asciugano più velocemente (Figura 2 H).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pulire il filtro.<ol>
<li>Sciacquare il setaccio delicatamente e accuratamente con acqua etanolo e ad osmosi inversa. Lasciarlo asciugare.</li>
			<li>Conservare in un contenitore pulito per un utilizzo futuro indefinito.</li>
			<li>Scartarla quando la rete si sviluppa un aspetto di "sag".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. convalida del setaccio di Caenorhabditis metodo di ordinamento
<ol><li>Manutenzione generale
	<ol>
<li>Per tutti gli esperimenti, cultura worms su un Nematode crescita Media standard17 (1 L di NGM è costituito da 2,5 g di peptone, 17 g di agar, 3 g di NaCl, 975 mL di acqua bidistillata, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL, 1 mL di 1 M CaCl2 1 mL di 1 M MgSO4, 25 mL di 1 M KHPO4e 0,5 mL di 100 mg/mL di streptomicina) a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Amministrazione di trattamento sperimentale
	<ol>
<li>Confrontare i tre gruppi di trattamento: pick, fluorodeossiuridina (FUDR) e Caenorhabditis setaccio.<ol>
<li>Per il gruppo di trattamento di FUDR, aggiungere 100 mg/mL FUDR ai media NGM ad una concentrazione finale di 100 μM per prevenire qualsiasi produzione di progenie e trasferire i vermi ogni altro giorno per un piatto fresco di NGM per evitare lo svuotamento del cibo.</li>
			<li>Per il gruppo di scelta, selezionare e trasferire i vermi manualmente utilizzando un'ansa di platino.</li>
			<li>Per il gruppo di trattamento del setaccio Caenorhabditis , seguire passo 1.2 e pipettare i vermi in un piatto NGM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Percentuale del rendimento del setaccio
	<ol>
<li>Per quantificare quanto sia efficace il setaccio è presso l'ordinamento di c. elegans, crescere età-sincrono N2 animali al giorno 1 dell'età adulta a 25 ° C (cioè, 48 ore dopo la deposizione delle uova) e poi trasferirli di raccoglierli per piatti freschi di NGM (per un totale N = 50 o N = 100 animali per tre gruppo di primarie).</li>
		<li>Dopo 24 h di recupero, trasferire la popolazione a nuove piastre di NGM con il setaccio di Caenorhabditis seguendo il precedente protocollo (Vedi punto 1.2) e contare il numero degli animali trasferiti con successo.</li>
		<li>Calcolare la percentuale del rendimento come il rapporto tra il numero degli animali trasferiti in confronto al numero di partenza all'inizio del trasferimento moltiplicato per 100 (%).</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan saggi Nota: Punteggio ottenuto healthspan parametri della classe motilità, il tasso di pompa faringea e sia l'anteriore che la posteriore tocco delicato risposta nei giorni 2, 4, 6 e 8 di età adulta per età-sincronizzato N2 animali mantenuti a 25 ° C.<ol>
<li>Motilità di rilevamento<ol>
<li>Assegnare i punteggi di motilità basati su un sistema basato su classi (classi A, B e C) seguendo i metodi di Herndon et al. 18. confrontare gli effetti dei tre gruppi sperimentali utilizzando un modello di statistiche logistica ordinale nel software di analisi statistica. Nota: Gli individui classe A muovono spontaneamente in un modello normale, sinusoidale. Individui di classe B spostare nei movimenti contrassegnato non sinusoidale e possono richiedere incitamento per incoraggiare la circolazione. Classe C individui spostare loro testa o la coda in risposta alla sollecitazione ma non sono in grado di spostarsi attraverso l'agar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Portata della pompa faringea<ol>
<li>Contare il movimento smerigliatrice della lampadina di pharyngeal terminale dell'animale visivamente sotto un microscopio stereoscopico a un 600 X ingrandimento finale per 1 min.</li>
			<li>Condurre un'analisi statistica con un one-way ANOVA con α = 0.05 e post-test di Bonferroni con α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Risposta al tocco<ol>
<li>Registrare una risposta al tocco delicato e confrontare tra tre gruppi di trattamento. Eseguire i saggi basati su metodi descritti da Calixto et al. 19.</li>
			<li>Risposta al tocco record anteriore e posteriore delicatamente accarezzando un pick ciglia perpendicolarmente attraverso la coda o la testa (5 x ogni, alternando testa e coda) degli animali.</li>
			<li>Punteggio ottenuto qualsiasi movimento nella direzione opposta del tratto come 1 punto su una scala da 0 a 5 per l'anteriore e il posteriore risposta.</li>
			<li>Condurre analisi statistica con un one-way ANOVA con α = 0.05 e post-test di Bonferroni con α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Dosaggio di fecondità
	<ol>
<li>Per determinare l'uso dell'impatto del setaccio Caenorhabditis sulla riproduzione, crescere età-sincrono N2 animali al giorno 2 dell'età adulta a 25 ° C.</li>
		<li>60 h dopo uovo laici, trasferire gli animali a nuove piastre di NGM con un plettro di platino o il setaccio di Caenorhabditis e dare loro 4 h per recuperare (asciugare le piastre setacciate per 20-30 min).</li>
		<li>Dopo il recupero, individualmente piastra gli animali tramite una ciglia pick a piastre NGM, dare loro 24h per deporre le uova e rimuovere gli animali. Consentire la progenie su ogni piatto di sviluppare in condizioni normali a 25 ° C per altre 24 ore. Nota: Un pick di ciglia è un ciglio umano fissato all'estremità di una pipetta di Pasteur con smalto e sterilizzata con etanolo.</li>
		<li>Contare il numero di individui di generazione F1 praticabili. Eseguire un'analisi statistica usando un T-test con α = 0.05. Nota: Prole vitali sono considerati da uova che si schiudono e cominciano il loro sviluppo attraverso i cicli regolari larvali con successo.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggi di risposta dello stress reporter fluorescente
	<ol>
<li>Eseguire tre saggi reporter fluorescenti comunemente utilizzati per rilevare potenziali markers di stress: una traslocazione di DAF-16::GFP in nuclei delle cellule in un ceppo [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; un'espressione di hsp-16,2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; e un' espressione sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Per ogni dosaggio, cultura età-sincrono animali da tre gruppi di trattamento a 20 ° C ed esaminarli al giorno 3 dell'età adulta: utilizzare un controllo negativo (su base giornaliera, trasferire un gruppo di animali manualmente con un plettro di platino), un controllo positivo (su base giornaliera trasferire un gruppo di animali manualmente con un plettro di platino più un fattore di sforzo stabilito) e il setaccio di Caenorhabditis (passano gli animali attraverso il setaccio e consentire loro di recuperare per 30 min in NGM appena prima di imaging).</li>
		<li>Nell'analisi della DAF-16::GFP, calore shock gli animali di controllo positivo a 37 ° C per 30 min prima dell'imaging di20. Per il dosaggio di hsp-16.2, calore shock gli animali di controllo positivo per 90 min, 20 h prima dell'imaging di21. Per il dosaggio di zolla-3, è necessario trattare gli animali di controllo positivo con il paraquat di 100 mM per 4 h prima dell'imaging di22.</li>
		<li>Raccogliere i vermi immediatamente con un prelievo di ciglia e montarle un vetrino coprioggetto con 1 μL di soluzione 36% poloxamer 407 tensioattivo per immobilizzare i vermi.</li>
		<li>I vermi montati con un altro vetrino coprioggetto un panino. Montare due lamelle ad un vetrino standard di microscopia e immagini i vermi con un ingrandimento 8x su un microscopio a fluorescenza invertito (per un ingrandimento complessivo di 80 X) e una costante esposizione con un filtro FITC.</li>
		<li>Per rilevare eventuali differenze tra i tre gruppi nel test DAF-16::GFP, classificare gli animali in base alla posizione del DAF-16::GFP reporter (nucleare se il reporter traslocata ai nuclei, citosolici se il giornalista si trova nel citosol e se intermedio il giornalista che si trova in entrambi i nuclei e citoplasma).</li>
		<li>Confrontare i risultati utilizzando un modello statistico di logistica ordinale nel software di analisi statistica. Per la hsp-16.2 e analisi della espressione sod-3, è possibile utilizzare un one-way ANOVA con α = 0.05 e prove di post hoc di Tukey con α = 0.05 per confrontare la fluorescenza totale della regione della testa.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare. Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Nel presente documento, abbiamo introdotto la progettazione e l'uso del setaccio Caenorhabditis accessibile, efficace come strumento per l'ordinamento e il mantenimento di c. elegans. Questo strumento presenta diversi vantaggi per picking manualmente singoli animali, popolazioni, trattamenti chimici (ad esempio, FUDR) e metodi più costosi degli animali segregating di lavaggio. In primo luogo, il Caenorhabditis setaccio efficientemente e rapidamente (meno di 20 min) Ordina progenie da grandi popolazioni miste di animali (tabella 2). Inoltre, l'uso dello strumento ha effetti tossici rilevabili su healthspan degli animali (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6), non induce stress genetico ben descritto reporter (Figura 7, Figura 8 Figura 9) e riduce la quantità di prodotto chimico straniero che poteva influenzare il trattamento applicato per le piastre di coltura o di qualsiasi analisi molecolare da allora in poi. La sua facilità d'uso è un vantaggio significativo; un ricercatore in qualsiasi fase della loro formazione possa essere addestrato ad usarlo (Figura 1 e Figura 2; Protocol).
I materiali richiesti per la fabbricazione e l'uso del setaccio (ad es., pipette, buffer) sono prontamente disponibili nei laboratori di ricerca standard; così, se rotto, il setaccio di Caenorhabditis non è costoso da sostituire o riparare. La natura auto-costruita del setaccio Caenorhabditis permette di essere uno strumento versatile: può essere costruito con maglie di dimensioni appropriate per diverse c. elegans fasi inerenti allo sviluppo e fenotipi. Il setaccio di Caenorhabditis può anche essere utilizzato in esperimenti condotti in altre specie di nematodi o quando isolare piccoli organismi, forniti la dimensione delle maglie appropriato viene utilizzato al momento della fabbricazione.
Oltre ai vantaggi questo strumento fornisce per manutenzione di popolazione di c. elegans , il setaccio può essere usato per pulire gli animali prima del loro utilizzo in altre applicazioni sperimentali. Ad esempio, con lo sviluppo della microfluidica di c. elegans di condurre ricerca arriva il numero di chip uso e pulizia. A seconda della quantità di batteri collegati agli animali, speciali precauzioni devono essere prese per non intasare il chip microfluidici, rendendolo inutilizzabile29. Spesso, quando c. elegans sono trasferiti a un chip microfluidici, residuo dal prato batterico è portato con loro. Questo residuo può e intasare i canali microfluidici, rendendo il malfunzionamento del chip, che quindi richiede la pulizia o la sostituzione. Il costrutto di dispositivo in questo protocollo offre un metodo per la raccolta non solo animali sincronizzati per microfluidica, ma anche per la pulizia degli animali prima del loro inserimento in un dispositivo microfluidico. Rimuovendo i detriti e residui batterici, preso quando raccoglie gli animali, i canali microfluidici sono meno soggetti a malfunzionamento, aumentando così la vita operativa dei singoli chip e il throughput successivo della ricerca condotta con loro.

Il verme nematode Caenorhabditis elegans, è un organismo modello premier. Oltre la natura semplice e controllata della loro coltivazione in laboratorio, è loro intero genoma sequenziato1 e il destino dello sviluppo di ogni cellula è noto2. Grazie a queste caratteristiche, c. elegans è un organismo di modello ampiamente usato per gli studi genetici. Tuttavia, insieme con queste caratteristiche benefiche vengono alcune sfide per i ricercatori. A causa del loro tempo di generazione rapida, popolazioni di c. elegans possono rapidamente a corto di cibo e/o diventano popolazioni con più generazioni miste e stadi di sviluppo presentano in una sola volta. Così, gli esperimenti eseguiti su supporti di solida crescita del nematode (NGM) richiedono ricercatori spostare fisicamente gli animali in piatti freschi prima esaurisce la fonte alimentare batterica e nuove larve si sviluppano. Questo può essere noioso come un frequente trasferimento degli animali è necessaria per prevenire le popolazioni sperimentali da diventando mescolato con generazioni di prole. Ancora, alcuni esperimenti richiedono entrambi i grandi numeri di animali e punti di tempo prolungato (ad es., estrazione di DNA o RNA in età adulta). Questo composti le sfide di accuratamente mantenendo una popolazione sincronizzata e il trasferimento di grandi quantità di animali.
Attuali metodi di trasferimento di c. elegans coltivati su NGM sono picking o lavare gli animali da piastra a piastra; trattare chimicamente gli animali (per esempio, con il DNA replica inibitore fluorodeossiuridina o FUDR); o mediante citometria a flusso per ordinare gli animali in piastre multi-pozzetto. Picking prevede l'utilizzo di uno strumento a mano, realizzato con un sottile filo di platino o un ciglio, trasferire manualmente i singoli o più animali3,4. Questo metodo è preciso ma richiede abilità e il tempo ed è una limitazione per gli studi che coinvolgono un numero elevato di animali. Picking maggio anche essere fisicamente dannosa e stressante per gli animali sottoponendo gli individui potenzialmente importi innaturali e incoerenti della dispersione e della forza. Lavaggio comporta una piastra di coltura con una soluzione tampone di risciacquo e trasferimento della soluzione con gli animali tramite vetro pipetta Pasteur di una nuova piastra di coltura. Questo metodo è rapido ed efficiente, ma non è accurato come più generazioni e stadi di sviluppo degli animali vengono trasferiti alla rinfusa. Trattamenti chimici, ad esempio FUDR, possono essere sciolto in coltura media per prevenire la produzione di prole attraverso il blocco di qualsiasi replica del DNA e quindi, lo sviluppo di uova e produzione di gameti. Mentre efficace, questo metodo deve essere applicato dopo la maturazione dello sviluppo per non interferire con i normali processi di sviluppo, e questo significa che c'è ancora un requisito per trasferire gli animali prima della sua amministrazione3. Questo metodo influisce anche più cellulari vie di segnalazione, con conseguente effetti notevoli sugli animali che invecchiano (ad esempio, un'estensione di durata della vita o un'alterata proteostasis) a seconda del ceppo di c. elegans utilizzato5, 6,7,8,9,10. Il flusso cytometry metodi automaticamente ordinare e trasferire singoli c. elegans da una piastra multi-pozzetto per un altro11. Mentre questo metodo è molto efficace ed efficiente, apparecchiatura di citometria a flusso è proibitivamente costosi e inaccessibili per molti ricercatori. Un'alternativa al trasferimento di animali consiste nell'utilizzare modelli di mutanti che sono termosensibili, quali fer-15 e fem-1, che diventano sterili con temperatura regolazione12. Durante l'utilizzo di animali mutanti è utile in alcune situazioni, questi ceppi specifici crescono più lentamente rispetto agli animali wild type e fanno affidamento su un genoma alterato, che serve come poveri rappresentanti per invecchiamento o sani vermi. Inoltre, il ricorso a un cambiamento di temperatura per indurre sterilità risultati anche in assenza di un ambiente statico, e cambiamenti di temperatura sono state prontamente indicati per influenzare gene espressioni13,14, 15. gruppi di ricerca sono pubblicati in precedenza tecniche che descrivono l'uso di una mesh per filtrare c. elegans di dimensioni16. Tuttavia, siamo riusciti a trovare un lavoro precedente test per eventuali modifiche negli esiti di salute globale che possono essere associati con l'uso di tali filtri.
C'è, così, un'esigenza di un metodo conveniente, efficiente, rapida e accurata per trasferire grandi quantità di animali tra piastre di coltura all'interno della comunità di ricerca di c. elegans . Abbiamo sviluppato un migliorato, accessibile pezzo di equipaggiamento (denominato il setaccio di Caenorhabditis ) e un protocollo associato per la fabbricazione e il suo funzionamento che soddisfa le esigenze della comunità di ricerca di c. elegans . Qui, condividiamo il design del setaccio di Caenorhabditis e metodi per il suo utilizzo, e dimostriamo che il suo utilizzo non influisce la salute comune o eventuali marcatori di stress rispetto alla raccolta manuale standard e un trattamento con il comunemente usati, limitare la fertilità chimica FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo di modello consolidata utilizzato in una gamma di ricerca biomedica di base. All'interno della comunità di ricerca del nematode, c'è un bisogno di un modo conveniente ed efficace per mantenere la popolazione di grande, di pari età di c. elegans. Qui, presentiamo una metodologia per meccanicamente l'ordinamento e la pulizia di c. elegans. Il nostro obiettivo è quello di fornire un processo conveniente, efficiente, veloce e semplice per ottenere animali di dimensioni uniformi e fasi della vita per il loro uso negli esperimenti. Questo strumento, il setaccio di Caenorhabditis , utilizza un sistema di coperchio su misura che discussioni sui tubi conici laboratorio comune e Ordina di c. elegans basato sulla dimensione del corpo. Inoltre dimostriamo che il setaccio di Caenorhabditis trasferisce efficacemente animali dalla piastra di una cultura ad un'altra che consente un ordinamento rapido, la sincronizzazione e pulizia senza impattare gli indicatori di salute, tra cui motilità e lo stress-viscoelastico reporter gene. Questo strumento innovativo e accessibile è un'opzione veloce, efficiente e non stressante per il mantenimento di popolazioni di c. elegans .

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.

Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K Views.  University of Alaska Fairbanks. Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.

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Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Ricerca

Genetica

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunologia e infezioni

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Neuroscienze

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biologia

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

Ordinamento dei<em&gt; Streptomyces</em&gt; Pellet cella utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatizzare la quantificazione aggregata in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Un approccio altamente scalabile per eseguire indagini ecologiche sui nematodi della caenorhabdite selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Dissezione manuale di Caenorhabditis elegans Intestini

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Dissociazione a singola cellula di Caenorhabditis elegans: un metodo per isolare le cellule vive

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Cultura e dosaggio delle popolazioni di caenorhabditis elegans a grande scala

Separazione automatica di

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode

Di base

Ordinamento dei

Automatizzare la quantificazione aggregata in Caenorhabditis elegans

Un approccio altamente scalabile per eseguire indagini ecologiche sui nematodi della caenorhabdite selfing

Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie

Dissezione manuale di Caenorhabditis elegans Intestini

Dissociazione a singola cellula di Caenorhabditis elegans: un metodo per isolare le cellule vive