Os autores gostaria de agradecer a Heather Currey por sua contribuição inicial para o projeto de estudo e Dr. Swarup Mitra para sua revisão crítica do manuscrito. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Michael B. Harris por comentários, refinamentos e assistência em produzir a demonstração desta metodologia. As cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio números UL1GM118991, TL4GM118992 ou RL5GM118990 e por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do o Instituto Nacional de General Medical Ciências do institutos nacionais da saúde sob concessão número 5P20GM103395-15. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. UA é um AA/EO empregador e a instituição educacional e proíbe a discriminação ilegal contra qualquer indivíduo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis peneira construção e uso
<ol><li>
Protocolo de construção
	<ol>
<li>Adquira 2 tampas de tubos de Erlenmeyer de 50 mL (figura 1A).</li>
		<li>Remover a área do centro dentro do lábio interior das tampas (quando visto de baixo, figura 1B) usando um bico de Bunsen e uma sonda de metal quente ou um ferro de solda ou pisar a broca. Nota: Usando o calor para cortar a tampa de plástico é preferível uma lâmina, porque há menos risco de lesão.</li>
		<li>Limpar e lixar as bordas cortadas e cubra a superfície com um arquivo curvado ou um rotativo moer ferramenta (por exemplo, Dremel). Ver Figura 1.</li>
		<li>Corte o círculo da malha monofilamento para o diâmetro apropriado (Figura 1). Para isso, trace uma tampa sobre uma folha de malha de nylon monofilamento e corte apenas dentro da linha desenhada.</li>
		<li>Corte barras/sulcos na superfície superior das tampas para melhorar a aderência das duas tampas, quando a cola é aplicada para o plástico (Figura 1E).</li>
		<li>Limpe as tampas com etanol e deixe-os secar.</li>
		<li>Aplique a cola de cianoacrilato para a superfície superior de ambas as tampas, mantendo a borda externa. Nota: um pouco de cola vai um longo caminho.</li>
		<li>Coloque o engranzamento do monofilamento, de acordo com a tabela 1, em uma tampa colada (Figura 1F). Coloque a segunda tampa invertida em cima da malha; ambas as tampas devem ter seus topos juntos. Pressione firmemente juntos (Figura 1). Certifique-se de que a malha é esticada. Nota: como medida de segurança, usar uma pinça para colocar a malha nas tampas.</li>
		<li>Uma vez que a camada inicial de cola secou, aplica um anel de cola de cianoacrilato em torno o fosso exterior entre as tampas. Ser generoso como isso agrega integridade e impede qualquer peeling separado ou com vazamento.</li>
		<li>Rotule o filtro com o tamanho de poro de malha da malha monofilamento. Nota: Aqui, usamos dois tamanhos de poros de malha — 20 µm e 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de uso
	<ol>
<li>Pre-molhado da peneira.<ol>
<li>Pipetar uma solução salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L de ultrapura H2O e 1 mL de MgSO4 (1m)]17, através do centro da peneira até formar uma gota , condensa e escorre para fora do centro da parte inferior do filtro (Figura 2A). Opcionalmente, aplicar um apagamento de fiapos (por exemplo, Kimwipe) para o fundo de forma ou espalhar uma gota de umidade na malha.</li>
			<li>Coloque a peneira sobre um tubo cónico de 50 mL. Rotular o tubo como 'Tubo de resíduos' (Figura 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave uma população de c. elegans sobre uma placa de ágar.<ol>
<li>Lavar a placa com o buffer M9 e coloque o meio contendo worm da parte de cima da malha monofilamento 1 mL de cada vez (Figura 2). Certifique-se de operar-se no centro da malha. Lave todos os vermes da placa. Nota: Normalmente, 3 mL de M9 para uma placa de 60 mm é suficiente.</li>
			<li>Para minimizar o número de vermes perdido na pipetagem, use um pipeta Pasteur de vidro para mover os vermes fora da placa e no centro da malha (repetição conforme necessário).</li>
			<li>Lave o filtro com o buffer M9 do topo. Novamente, certifique-se de operar-se no centro da malha e lave todos os vermes nessa área. Lave quantas vezes for necessário para garantir que todas as bactérias e vermes menores passaram a malha.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Os animais de tamanho correspondente da peneira da colheita.<ol>
<li>Anexe um novo tubo cónico de 50 mL para a parte superior da peneira, com os vermes adultos da etapa 1.2.2.3 voltados para dentro do tubo da nova coleção (Figura 2D).</li>
			<li>Remover o primeiro tubo (resíduos) e rapidamente vire a peneira e tubo novo para impedir a migração da gota (Figura 2E). Nota: Se esterilidade não é necessária, use uma limpeza de fiapos (por exemplo, Kimwipe) ao pavio fluido de baixo da malha antes de virar.</li>
			<li>Enxágue a malha com M9 no novo tubo 50 mL do bordo novo (Figura 2F). Novamente, operar no centro da malha e a manter uma gota na parte de baixo da malha.</li>
			<li>Permitir que os vermes resolver ou spin-os suavemente para baixo (por exemplo, < x 16 g) por aproximadamente 1 min (Figura 2).</li>
			<li>Aspirar a solução-tampão da pelota de vermes, idealmente para > 0,5 mL, ou remover todo o líquido possível sem perturbar o sedimento.</li>
			<li>Pipetar os vermes usando um pipeta Pasteur em um prato NGM do vidro e deixe-os secar. Espaço múltiplas gotículas fora em um prato novo para secar mais rápido (Figura 2 H).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Limpe o crivo.<ol>
<li>Enxágue a peneira delicadamente e completamente com água etanol e osmose reversa. Deixe-o secar.</li>
			<li>Armazená-lo em um recipiente limpo para uso futuro indefinido.</li>
			<li>Descartá-lo quando a malha desenvolve uma aparência de "sag".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. validação de peneira Caenorhabditis , método de classificação
<ol><li>Manutenção geral
	<ol>
<li>Para todos os experimentos, cultura vermes num padrão de nematódeo crescimento Media17 (1L de NGM consiste de 2,5 g de peptona, 17 g de ágar-ágar, 3 g de NaCl, 975 mL de água bidestilada, 1 mL de colesterol de 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL, 25 mL de 1m KHPO4e 1 mL de 1 M de MgSO4) a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Administração de tratamento experimental
	<ol>
<li>Compare os três grupos: picareta, fluorodeoxyuridine (FUDR) e Caenorhabditis peneira.<ol>
<li>Para o grupo de tratamento FUDR, adicionar 100 mg/mL FUDR para a mídia NGM para uma concentração final de 100 μM para impedir qualquer produção de descendência e transferir os vermes todos os dias para um prato NGM fresco para evitar o esgotamento de comida.</li>
			<li>Para o grupo escolher, selecionar e transferir os vermes manualmente usando um loop de platina.</li>
			<li>Para o grupo de tratamento de peneira Caenorhabditis , siga a etapa 1.2 e pipetar os vermes em um prato NGM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Percentagem do rendimento da peneira
	<ol>
<li>Para quantificar como a peneira é eficaz na classificação de c. elegans, crescer idade-síncrono N2 animais para 1 dia de idade adulta, a 25 ° C (ou seja, 48 h após a postura de ovos) e depois transferi-los por pegá-los para novas placas NGM (totalizando N = 50 ou N = 100 animais por tre grupo de atment).</li>
		<li>Após 24h de recuperação, transferir a população para novas placas NGM com o crivo de Caenorhabditis seguindo acima do protocolo (consulte a etapa 1.2) e contar o número de animais transferidos com êxito.</li>
		<li>Calcule a percentagem do rendimento como a relação entre o número de animais transferidos em comparação com o número inicial no início da transferência multiplicado por 100 (%).</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios Healthspan Nota: Pontuação healthspan parâmetros de classe de motilidade, a taxa de bomba da faringe e tanto o anterior e a posterior toque suave resposta nos dias 2, 4, 6 e 8 da maioridade para idade-sincronizado N2 animais mantidas a 25 ° C.<ol>
<li>Motilidade de rastreamento<ol>
<li>Atribuir pontuações de motilidade, baseadas em um sistema baseado em classe (classes A, B e C) seguindo os métodos de Herndon et al . 18. comparar os efeitos dos três grupos experimentais usando um modelo de estatísticas logístico ordinal em software de análise estatística. Nota: Os indivíduos de classe A mover-se espontaneamente em um padrão normal, sinusoidal. Indivíduos de classe B mover-se em movimentos marcadamente não-sinusoidal e podem exigir cutucando para encorajar a circulação. Indivíduos de classe C mover sua cabeça e/ou cauda em resposta ao estímulo, mas são incapazes de se mover através de agar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Taxa de bomba da faringe<ol>
<li>Conte o movimento moedor do bulbo de faríngea terminal do animal visualmente sob um estereomicroscópio com uma 600 X ampliação final por 1 min.</li>
			<li>Realizar uma análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Resposta de toque<ol>
<li>Gravar uma resposta de toque suave e comparar entre os três grupos. Realizar os ensaios com base em métodos descritos por Calixto et al . 19.</li>
			<li>Registro anterior e posterior toque resposta por suavemente acariciando um picador de cílios perpendicularmente através da cauda ou na cabeça (5x cada, alterna cabeça e cauda) dos animais.</li>
			<li>Marca qualquer movimento no sentido oposto do traço como 1 ponto em uma escala de 0 a 5 para o anterior e a posterior resposta.</li>
			<li>Realizar análise estatística com uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e pós-testes de Bonferroni com α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de fecundidade
	<ol>
<li>Para determinar o uso do impacto da peneira Caenorhabditis na reprodução, crescer idade-síncrono N2 animais ao dia 2 de idade adulta, a 25 ° C.</li>
		<li>60h depois põem ovos, transferir os animais para novas placas NGM com um picador de platina ou a peneira Caenorhabditis e dar-lhes a 4 h para recuperar (seque as placas peneiradas para 20-30 min).</li>
		<li>Após a recuperação, individualmente placa os animais através de um cílio escolher placas de NGM, dar-lhes 24 h para colocar ovos e remover os animais. Permitir que a descendência em cada placa para desenvolver em condições normais, a 25 ° C para outro 24h. Nota: Um picador de cílios é um cílio humano garantiu à extremidade de uma pipeta Pasteur com esmaltes e esterilizados com etanol.</li>
		<li>Conte o número de indivíduos de geração F1 viáveis. Realizar uma análise estatística utilizando um T-teste com α = 0,05. Nota: Prole viável é considerados os ovos que eclodem e iniciam o seu desenvolvimento através dos ciclos regulares larvas com êxito.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de resposta de estresse repórter fluorescentes
	<ol>
<li>Realizar três ensaios de repórter fluorescentes comumente usado para detectar potenciais marcadores de estresse: uma translocação DAF-16::GFP para os núcleos das células em uma cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; uma expressão de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; e uma expressão de sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>Para cada ensaio, cultura idade-síncrono animais dos grupos de tratamento de três a 20 ° C e examiná-los no dia 3 de idade adulta: usar um controle negativo (em uma base diária, de transferência de um grupo de animais manualmente com um picador de platina), um controle positivo (em uma base diária transferência de um grupo de animais manualmente com uma picareta platinum plus um estressor estabelecido) e o crivo de Caenorhabditis (passar os animais através da peneira e permitir-lhes a recuperar por 30 min em NGM antes de imagem).</li>
		<li>No ensaio de DAF-16::GFP, calor choque os animais controle positivo a 37 ° C por 30 min antes de20de imagem. Para o ensaio de hsp-16.2, calor choque os animais controle positivo para 90 min, 20 h antes de imagem21. Para o ensaio de sod-3, trate os animais de controle positivo com paraquat 100 mM por 4h antes de22de imagem.</li>
		<li>Colher os vermes imediatamente com um picador de cílios e montá-los para uma lamela com 1 μL de solução 36% Poloxâmero 407 surfactante para imobilizar os vermes.</li>
		<li>Sanduíche dos vermes montados com outra lamela. Monte as duas lamelas de uma lâmina de vidro padrão de microscopia e imagem os vermes usando uma ampliação X 8 em um microscópio fluorescente invertido (para uma ampliação total de 80 X) e uma exposição constante com um filtro FITC.</li>
		<li>Para detectar quaisquer diferenças entre os três grupos no ensaio de DAF-16::GFP, categorizar os animais com base na localização do repórter DAF-16::GFP (nuclear, se o repórter translocados para núcleos, citosólico se o repórter localizado no citosol e o intermediário se o repórter localizado em ambos os núcleos e citoplasma).</li>
		<li>Compare os resultados usando um modelo estatístico de logística ordinal em software de análise estatística. Para o hsp-16.2 e os ensaios de expressão sod-3, use uma One-Way ANOVA com α = 0,05 e testes post hoc de Tukey com α = 0,05 para comparar a fluorescência total da região da cabeça.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mechanosensation.">Assaying mechanosensation.</a> WormBook. , (2014).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Mitochondrial+Superoxide+Dismutase+sod-2+Extends+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Argon, Y., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+fertilization-defective+mutants+with+abnormal+sperm.">Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm.</a> Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).</li><li>Lee, S. J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+longevity+response+to+temperature+by+thermosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Temperature+Differentially+Modulates+C.+elegans+Longevity+through+a+Thermosensitive+TRP+Channel.">Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel.</a> Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).</li><li>Michaelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans:+A+Practical+Approach.+Ian+A.+Hope+(ed.).+Oxford+University+Press,+Oxford.+1999.+Pp.+281.+ISBN+0+19+963738+5.">C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5.</a> Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans.">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li><li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li><li>Henderson, S. T., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+integrates+developmental+and+environmental+inputs+to+mediate+aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan.">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li><li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit.">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li><li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neuron+aging:+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).</li><li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis.">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).</li><li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li><li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress.">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li><li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar. Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Aqui, apresentamos o projeto e uso da peneira Caenorhabditis acessível, eficaz como uma ferramenta para classificação e mantendo o c. elegans. Esta ferramenta tem várias vantagens para escolher manualmente a animais individuais, lavando as populações, tratamentos químicos (por exemplo, FUDR) e métodos mais caros dos animais segregam. Primeiro, o Caenorhabditis peneira eficientemente e rapidamente (menos de 20 min) classifica a descendência de grandes populações mistas de ani...

O verme nematoide, Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo premier. Além da natureza simples e controlada do seu cultivo em laboratório, todo o seu genoma é sequenciado1 e o destino do desenvolvimento de cada célula é conhecido2. Devido a estas características, c. elegans é um organismo modelo amplamente usado para estudos genéticos. No entanto, juntamente com estas características benéficas vem alguns desafios para os pesquisadores. Devido ao seu tempo de geração rápida, as populações de c. elegans rapidamente podem ficar sem comida e/ou se misturam as populações com várias gerações e estádios de desenvolvimento presentes ao mesmo tempo. Assim, experimentos realizados na mídia de crescimento sólido de nematoides (NGM) exigem pesquisadores mover fisicamente os animais para placas frescas antes da fonte de alimento bacteriana esgota e desenvolvem novas larvas. Isto pode ser tedioso como uma transferência frequente dos animais é necessária para evitar as populações experimentais de tornar-se misturado com gerações de prole. Ainda, alguns experimentos requerem ambos grande número de animais e de pontos de tempo prolongado (por exemplo, extração de DNA ou RNA na idade adulta). Este compostos os desafios com precisão, mantendo uma população sincronizada e transferir um grande número de animais.
Métodos atuais de transferência de c. elegans cultivadas em NGM estão escolhendo ou lavar os animais de placa para placa; quimicamente, tratando os animais (por exemplo, com o DNA replicação inibidor fluorodeoxyuridine ou FUDR); ou usando citometria de fluxo para classificar os animais em placas multi bem. Colheita envolve o uso de uma ferramenta de mão, feito com um arame fino de platina ou um cílio, para transferir manualmente o indivíduo ou vários animais3,4. Esse método é preciso, mas requer habilidade e tempo e é uma limitação de estudos envolvendo um grande número de animais. Escolher o maio também ser fisicamente prejudiciais e estressante para os animais potencialmente sujeitando indivíduos quantias antinatural e inconsistente de perturbação e força. Lavar roupa envolve um prato de cultura com uma solução tampão de lavagem e transferir a solução com os animais através de uma pipeta Pasteur de vidro para uma nova placa de cultura. Este método é rápido e eficiente, mas não é exato, como várias gerações e estádios de desenvolvimento dos animais são transferidos em massa. Tratamentos químicos, tais como FUDR, podem ser dissolvidos na mídia cultivo para impedir a produção de descendência através de bloquear qualquer replicação do DNA e, portanto, o desenvolvimento de ovos e produção de gametas. Pouco eficaz, este método deve ser aplicado após a maturação do desenvolvimento como para não perturbar os processos do desenvolvimento normais, e isso significa que ainda há um requisito para transferir os animais antes da sua administração3. Esse método também influencia vários celulares vias de sinalização, resultando em efeitos visíveis dos animais com a idade (por exemplo, uma extensão de vida útil ou um proteostasis alterada) dependendo da cepa de c. elegans usado5, 6,7,8,9,10. Métodos de citometria de fluxo automaticamente classificar e transferir individual c. elegans de uma placa multi bem para outro11. Enquanto este método é muito eficaz e eficiente, equipamento de citometria de fluxo é proibitivamente caro e inacessível para muitos pesquisadores. Uma alternativa para transferência de animais é usar modelos mutantes que são sensível, tais como fer-15 e fem-1, que se tornam estéreis com ajuste de temperatura12de temperatura. Enquanto usar animais mutantes é útil em algumas situações, estas cepas específicas crescem mais lentamente do que os animais selvagem-tipo e eles contam com um genoma alterado, servindo como pobres representantes para vermes envelhecimento ou saudáveis. Além disso, a dependência de uma mudança de temperatura para induzir esterilidade também resulta na ausência de um ambiente estático, e mudanças de temperatura foram prontamente mostradas para influenciar o gene expressões13,14, 15. grupos de pesquisa têm publicado anteriormente técnicas descrevendo o uso de uma malha para filtrar c. elegans por tamanho16. No entanto, fomos capazes de encontrar trabalhos anteriores testes para qualquer alteração nos resultados saúde geral podem ser associados com o uso de tais filtros.
Há, assim, uma necessidade um método acessível, eficiente, rápido e preciso para transferir um grande número de animais entre placas de cultura dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans . Nós desenvolvemos uma peça melhorada, acessível do equipamento (chamado Caenorhabditis peneira) e um protocolo associado para sua manufatura e operação que atenda às necessidades da comunidade de pesquisa de c. elegans . Aqui, partilhamos o projeto do Caenorhabditis peneira e métodos para sua utilização, e demonstramos que seu uso não afeta a saúde comum ou qualquer marcadores de estresse quando comparado a colheita manual padrão e um tratamento com o comumente usados, restrição da fertilidade química FUDR.

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo de bem-estabelecida modelo usado em toda uma gama de pesquisas básicas e biomédica. Dentro da comunidade de pesquisa nematoide, há uma necessidade de uma maneira acessível e eficaz para manter as populações grandes, idade-combinadas de c. elegans. Aqui, apresentamos uma metodologia para mecanicamente classificação e limpeza c. elegans. O nosso objectivo é fornecer um processo econômico, eficiente, rápido e simples para obter animais de tamanhos uniformes e estágios de vida para a sua utilização em experiências. Esta ferramenta, o crivo de Caenorhabditis , usa um sistema de tampa custom-built que tópicos para tubos comuns de laboratório cónico e classifica c. elegans com base no tamanho do corpo. Também demonstramos que a peneira Caenorhabditis efetivamente transfere animais de placa de uma cultura para outra que permite uma classificação rápida, sincronizando e limpeza sem afetar marcadores de saúde, incluindo a motilidade e stress-inducible repórteres do gene. Esta ferramenta acessível e inovadora é uma opção rápida, eficiente e não estressante para manter as populações de c. elegans .

A peneira de Caenorhabditis consiste de 2 tampas de rosca, protegendo uma área de malha de monofilamento de nylon tecido menor que o diâmetro do corpo da época do desenvolvimento desejado, usado para extrair ao vivo populações de organismos usando uma técnica simples lavagem. Ele atribui aos tubos cónicos padrão e usa a tela de engranzamento mecanicamente classificar animais pelo diâmetro do corpo, deixando os animais desejados no tubo pronto para mais manutenção e exp...

Watch this Scientific Journal Video about Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms at JoVE.com

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.

Caenorhabditis Peneira: Um instrumento de baixa tecnologia e metodologia para classificação de pequenos organismos multicelulares

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K visualizações.  University of Alaska Fairbanks. O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.

Vídeo: Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genética

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

A separação automática de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Imunologia e Infecção

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Neurociência

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biologia

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

Classificando de<em&gt; Streptomyces</em&gt; pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Dissecção da Mão de Caenorhabditis elegans Intestinos

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Caenorhabditis Peneira: Um instrumento de baixa tecnologia e metodologia para classificação de pequenos organismos multicelulares

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

A separação automática de

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo

Básico

Classificando de

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Microdisseção a laser para aplicações de tecido único agnóstico de espécies

Dissecção da Mão de Caenorhabditis elegans Intestinos

Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas