Name: visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified λ dna at the single molecule level
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified Î» DNA at the Single Molecule Level at JoVE.com

Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.

1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317
<ol><li>Imballaggio e la costruzione di DNA substrato<ol>
<li>Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omologa e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Per assemblare il DNA di λ di ricombinazione, aggiungere 25 µ l di lambda imballaggio estratti nel prodotto ricombinazione e incubi la reazione a 30 ° C per 90 min. Quindi, aggiungere un ulteriore 25 µ l di lambda imballaggio estratti nella provetta di reazione. Continuare a incubare la reazione a 30 ° C per 90 min.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di diluizione sterile (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl2) nel sistema di reazione e mescolare delicatamente ruotando il tubo capovolto più volte. Aggiungere 25 µ l di cloroformio, mescolare delicatamente e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l del fago confezionato e 100 µ l di batteri LE392MP (coltivate a 0.8 - 1.0 usando LB medium aggiunta con 10mm MgSO4) in una nuova provetta. Incubare a 37 ° C per 15 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di miscela dei fagi-batterio in 4 mL di agar Ditop (LB medium + 0,7% agar + 10mm MgSO4, raffreddata a 48 ° C). Mescolare immediatamente ruotando il tubo capovolto più volte e versarla su un piatto pre-riscaldata (37 ° C) LB.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte e la placca di λ-ARS317 mediante PCR e sequenziamento a schermo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione di DNA substrato da lisati liquido11,18<ol>
<li>Raccogliere una placca in 200 µ l di ddH sterile2O con 10 mM MgCl2 e 10 nM CaCl2. Mescolare con 200 µ l di batteri LE392MP (coltivata pernottamento in mezzo LB) e incubare a 37 ° C per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere la miscela dei fagi-batterio in 100 mL di NZCYM (10 g/L NZ-ammina, 5g/L lievito estratto, 5g/L NaCl, 1 g/L Casamino idrolizzato e MgSO4·7H2O 2 g/L) media e cultura per 7 h a 37 ° C. Aggiungere 250 µ l di cloroformio nella cultura ed agitare per altri 10 min.</li>
		<li>Diffondere la cultura in una beuta da 200 mL. Aggiungere 5,8 g di NaCl (concentrazione finale di 1 M), mescolare per sciogliere a mano e incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante in una beuta da 200 mL e aggiungere 10% PEG8000 (m/V). Mescolare per sciogliere col mescolatore magnetico e incubare in ghiaccio per 30 minuti o più.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per far precipitare il batteriofago. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il precipitato in 2 mL di tampone di diluizione dei fagi. Trasferirlo in una provetta da 15 mL e aggiungere 10 µ l di RNAsi (concentrazione finale è 20 µ g/mL) e 40 µ l di dnasi (concentrazione finale è 5 µ g/mL). Incubare a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, proteinasi di 15 µ l K (concentrazione finale è di 10 µ g/mL). Incubare a 65 ° C per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di acetato di potassio pre-raffreddata (3M, pH 4.8) e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min.</li>
		<li>Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile.</li>
		<li>Aggiungere 0,7 x volume di isopropanolo nel surnatante. Mescolare ruotando il tubo capovolto più volte e incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a RT per precipitare il DNA. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare il DNA una volta con 70% etanolo mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min. eliminare il surnatante.</li>
		<li>Eluire il DNA utilizzando delicatamente il tampone di 500 µ l TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) e trasferire il DNA in provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Estrarre il DNA due volte con il fenolo: cloroformio mediante centrifugazione a 8.000 g per 10 min.</li>
		<li>Precipitare con 0,7 x volume di isopropanolo. Mescolare girando il tubo testa in giù delicatamente e centrifugare a 8.000 x g per 10 min.</li>
		<li>Lavare una volta con etanolo al 70%, risospendere in 200 µ l di TE. Misurare la concentrazione di DNA e conservare a-20 ° C in 12,5 µ g aliquote.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA biotinilazione
<ol><li>Fosforilare oligonucleotidi biotinilati (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementari all'estremità sinistra del nativo di λ DNA, aggiungere 1 µ l (100 µM) di oligonucleotidi, 7,5 µ l di ddH2O, 1 µ l di tampone di ligasi 10x e 0,5 µ l di T4 PNK. Incubare la reazione a 37 ° C per 3 h.</li>
	<li>Per fosforilare λ-ARS317, aggiungere 12,5 µ g di λ-ARS317, 3 µ l di tampone di ligasi 10x, 1 µ l di T4 PNK e ddH2O al volume totale di 30 µ l. incubi la reazione a 37 ° C per 3 h.</li>
	<li>Per temprare oligonucleotidi con λ-ARS317, aggiungere 0,5 µ l di oligonucleotidi fosforilati, 195 µ l di ddH2O, 25 µ l di tampone di ligasi × 10 nel tubo fosforilato λ-ARS317. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a 65 ° C per 5 min turno spento il riscaldatore blocco e lasciare raffreddare il campione a inferiore a 33 ° C nel blocco.</li>
	<li>Per lega i oligonucleotides con λ-ARS317, aggiungere 1 µ l di T4 DNA ligasi e 0,63 µ l del trifosfato di adenosina (200 mM). Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 2 h o a 4 ° C durante la notte. Conservare a 4 ° C per 1 mese. Nota: Per evitare di rompere il DNA, tutte le fasi di miscelazione devono essere eseguite capovolgendo delicatamente il tubo, invece di mescolare utilizzando pipette.</li>
</ol>3. vetrino coprioggetto pulizia e funzionalizzazione
<ol><li>Vetrino coprioggetti pulizia<ol>
<li>Posto 20 vetrini coprioggetti in 4 vaschette per colorazione (5 vetrini coprioggetti/vasetto), Sonicare per 30 minuti in etanolo e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte.</li>
		<li>Sonicare per 30 minuti con 1 M di idrossido di potassio (KOH) e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte. Ripetere l'etanolo e KOH sonicazione una volta.</li>
		<li>Sonicare con acetone per 30 minuti e poi sciacquare abbondantemente con ultrapura H2O (almeno 3 volte). Nota: Acetone deve essere rimosso completamente risciacquando con ultrapura H2O, perché può causare un'esplosione quando solvente organico (ad esempio acetone) mescolato con la soluzione piranha erroneamente14.</li>
		<li>Inserire i vetrini coprioggetto soluzione piranha (miscela 3:1 di H2SO4 e 30% H2O2) e incubare a 95 ° C per 1 h. Nota: La soluzione Piranha è altamente energico e corrosiva, quindi usare con cautela. Quando si prepara la soluzione piranha, aggiungere 50 mL di H2O2 prima in un becher di vetro 500 mL e quindi aggiungere 150 mL di H2così4 lentamente nel bicchiere graduato.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 5 volte. Quindi lavare ogni vetrino coprioggetti con ultrapura H2O accuratamente con 3 bicchieri riempiti con ultrapura H2O ed asciugare il vetrino coprioggetto utilizzando carta dal bordo del coverslip. Inserire la vaschetta di colorazione del vetrino coprioggetto e asciugare il vetrino coprioggetto accuratamente in forno a 110 ° C per 30 minuti.<ol>
<li>Sciacquare il vetrino coprioggetto con metanolo e mettere la vaschetta di colorazione in forno 110 ° C per asciugare il vetrino coprioggetti. Nota: Asciugare accuratamente il vetrino coprioggetto è molto importante, perché APTES avrà un sacco di possibili strutture superficiali, una volta che si è in presenza di acqua19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vetrino coprioggetti funzionalizzazione<ol>
<li>Aggiungere 70 mL di soluzione di silano (93% metanolo, 5% acetico e 2% APTES) in ogni vaso, avvitare il tappo e lasciare il vaso a temperatura ambiente durante la notte.</li>
		<li>Lavare e asciugare i vetrini coprioggetti, come descritto al punto 3.1.5, tranne per il fatto asciugare i vetrini coprioggetti accuratamente con gas azoto invece di metterli in forno.</li>
		<li>Sciogliere 150 mg di mPEG (metossi-polietilene glicole) e 6 mg di biotina-PEG (biotina-polietilenglicole) in 1 mL di 0.1 M fresca fatta NaHCO3 (pH 8.2) accuratamente. Poi Centrifugare a 17, 000 x g per 1 min a togliere pioli insolubile. Nota: Appena fatte NaHCO3 è pronto; non c'è nessuna necessità di regolare il suo pH.</li>
		<li>Posizionare i vetrini coprioggetti silanizzata nelle caselle e mettere due vetrini coprioggetti piccoli sulla parte superiore due estremità delle lamelle silanizzato. Pipettare 100 µ l di soluzione di PEG sul centro del coprivetrino silanizzata e inserire un altro vetrino coprioggetti silanizzata in alto a sinistra.</li>
		<li>Aggiungere alcuni ultrapura H2O nella finestra per mantenerlo umido e incubare i vetrini coprioggetti con soluzione PEG per almeno 3 ore al buio. Un'incubazione overnight può lavorare bene.</li>
		<li>Separare le coppie di coprioggetto e continuate il volto di superficie funzionalizzato, sciacquare i coprioggetti usando ultrapura H2O ampiamente e asciugarle con gas azoto.</li>
		<li>Contrassegnare il lato funzionalizzato di lamelle su uno degli angoli utilizzando un pennarello, tenere il lato funzionalizzato affrontare, metterli in scatole e archiviazione le caselle in un essiccatore sotto vuoto per 1 mese.</li>
		<li>Per memorizzare i coprioggetti per un tempo più lungo, porre un coprivetrino in una provetta da 50 mL forata con un buco sul suo tappo, poi mettere il tubo in un sacchetto di plastica e sigillare il sacchetto usando una macchina per il sottovuoto. In questo modo, lamelle possono essere immagazzinate a-20 ° C circa 3 mesi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. flusso Cell Assembly
<ol><li>Tagliare un canale 15 × 2 mm al centro di un pezzo di nastro biadesivo (30 mm × 12 mm) utilizzando un perforatore.</li>
	<li>Staccare il lato della carta del nastro biadesivo e incollarlo sul vetrino con due fori. Premere per rimuovere le bolle d'aria. Basandoci sulla nostra esperienza, è più facile rimuovere le bolle d'aria di pelatura fuori il lato della carta rispetto al lato di plastica del nastro biadesivo.</li>
	<li>Tagliare un vetrino coprioggetti funzionalizzato (60 mm × 24 mm) in quattro pezzi (30 mm × 12 mm) utilizzando un punta di diamante di vetro scribe e rimuovere i detriti utilizzando gas azoto. Ricordarsi di tenere il funzionalizzati lato faccia in su.</li>
	<li>Staccare la plastica laterale del nastro biadesivo e incollare la diapositiva il coprivetrino funzionalizzato. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria tra il nastro e il vetrino coprioggetti. Rimozione di bolle d'aria accuratamente può proteggere la cella di flusso da perdite mentre buffer sono stati pompati in esso.</li>
	<li>Inserire aspirazione e tubo di uscita nei fori piccoli e grandi, rispettivamente. Fissare il tubo con resina epossidica.</li>
	<li>Pompa 20 µ l di streptavidina (0,2 mg/mL) nella cella di flusso utilizzando una siringa manualmente e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Quindi pompa blocco buffer10 nella cella di flusso per sostituire streptavidina e tenerlo a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. singola molecola Visualization
<ol><li>Ottenere l'allineamento focale del rosso e da' con A5 sulla prova di microscopio di fluorescenza #1 eccitazione simultanea utilizzando un laser a 532 nm e laser 640 nm. Produrre immagini di doppia lunghezza d'onda con la scissione ottica (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Posizionare la cella di flusso sul microscopio e collegare il tubo di uscita per un più lungo collegamento tubazione con una molla di 10ml installata su una pompa di infusione/ritiro automatici programmabili. Nota: Pompaggio buffer nella cella di flusso indicato di seguito significa ritirare buffer dal tubo di ingresso della cella di flusso alla siringa.</li>
	<li>Pompa tampone bloccante a 500 µ l/min nella cella di flusso per rimuovere rapidamente l'aria e garantire che il buffer nella cella di flusso è sbloccato. Pompare il tampone bloccante a 200 µ l/min nella cella di flusso, quindi capovolgere il tubo di uscita per rimuovere le bolle d'aria dal tubo di aspirazione e la cella di flusso accuratamente. Nota: Tutti i buffer pompati nella cella di flusso dovrebbero essere degassificati in un essiccatore sotto vuoto per almeno 15 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 µ l di DNA λ-ARS317 biotinilati in 80 µ l di tampone bloccante e pompa in cella di flusso a 25 µ l/min per 2 min. Quindi sciacquare λ-ARS317 DNA utilizzando 200 µ l di tampone bloccante ad un tasso di 50 µ l/min.</li>
	<li>200 µ l di binding buffer10 ad un tasso di 50 µ l/min per rimuovere il tampone bloccante nella cella di flusso della pompa.</li>
	<li>Aggiungere 0,2 µ l di rivestite con streptavidina Qdot705 (1 µM) e 0,2 µ l di biotinylated ORC (1,2 µM) in una provetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 20 µ l di binding buffer nel tubo, quindi posizionarlo sul ghiaccio. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di circa 10 nM.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µ l di DTT (100 mM), 1 µ l di ATP (200 mM) in 96 µ l di tampone di associazione. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di 0,2 nM.</li>
	<li>Nella cella di flusso della pompa 20 µ l di 0,2 nM ORC-Qdot705 al tasso di 10 µ l/min. Scovare di eccessiva ORC-Qdot705 utilizzando 200 µ l di tampone di associazione al ritmo di 100 µ l/min. Quindi pompa buffer obbligatorio con 30 nM SYTOX arancio nella cella di flusso a macchiare substrati DNA ad un tasso di 100 µ l/min.</li>
	<li>Eccitare il segnale di705 ORC-Qdot e SYTOX arancio macchiato segnale di DNA utilizzando un laser di 405 nm e 532 nm laser, rispettivamente. Osservare i segnali simultaneamente con 100 µ l/min flusso utilizzando un filtro passabanda Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) e registrare le immagini di EM-CCD con 100 ms per ogni frame. Raccogliere 20 serie di immagini provenienti da diversi campi.</li>
</ol>6. analisi dei dati
<ol><li>Ritaglia le immagini usando il software di Fiji con un nuovo plugin, che viene modificato da noi stessi basate sul plugin Image (OI_cut_RGBmerge) sviluppato da laboratorio di Dr. Ron Vale presso University of California, San Francisco.<ol>
<li>Ritagliare una pila di immagini (512 × 512 pixel) in due pile di immagini (256 × 256 pixel). Uno è un 532 nm laser risultato entusiasmante, e l'altro è un 405 nanometro laser risultato entusiasmante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processo di 61 immagini sequenziali utilizzando Fiji-immagine-pile-Z project (intensità media).</li>
	<li>Misura la lunghezza del DNA (LDNA) e la distanza dal sito di ORC-Qdot705 (LORC) associazione il DNA al DNA legato fine manualmente.</li>
	<li>Calcolare il risultato della LORC/lDNA utilizzando excel, analizzare i dati utilizzando il metodo bootstrap di R, quindi creare l'istogramma e distribuzioni gaussiane in forma.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre eventuali danni, ad esempio, evitare di mischiare pipettando su e giù ripetutamente. In secondo luogo, è molto importante garantire che il vetrino coprioggetto è abbastanza pulito per ridurre al minimo il rumore di fondo. Durante il processo di pulizia e funzionalizzazione del vetrino coprioggetto, acqua dovrebbe raggiungere il livello ultrapura, e l'aria dovrebbe essere privo di polvere. È meglio svolgere la funzionalizzazione del vetrino coprioggetto e l'assemblaggio di cella di flusso su un banco pulito.
Nell'analisi della singola molecola per lo studio delle interazioni proteina-DNA, DNA λ è un substrato appropriato con diversi vantaggi20. DNA di λ è abbastanza a lungo per essere facilmente osservato e permettere la registrazione movimento proteina su di esso in un esperimento di singola molecola. Inoltre, gli strapiombi di ssDNA permettono molti disegni per il tethering λ DNA su un vetrino coprioggetti. In questo studio, presentiamo un metodo per inserire un frammento di DNA esogeno in un sito specifico del DNA λ. Così, vari frammenti di DNA definibili dall'utente possono essere integrati nel DNA di λ. Il DNA modificato λ può essere convenientemente purificato da lisati liquidi in grandi quantità per studio di singola molecola.
È difficile valutare l'efficienza d'etichettatura con precisione nel Qdot rivestite con streptavidina etichettatura analisi perché ci sono circa 5-10 streptavidins a Qdot nanocristallo. Di conseguenza, il rapporto molare appropriato di QDOT rivestite con streptavidina e proteine biotinilate dovrebbe essere ottimizzato negli esperimenti. Un rapporto molare 1:1 può essere un riferimento.
Dovrebbe essere notato che Qdot non può essere utilizzato nelle analisi quantitative accurate poiché sua elevata fotostabilità è inadatto per il dosaggio di foto-candeggio. Sebbene l'elevata stabilità di QDOT limita la sua applicazione nelle analisi quantitative, consente di facile osservazione e monitoraggio da lungo tempo5. Con l'aumento di applicazioni di microscopia di fluorescenza di singola molecola in biologia, il protocollo descritto in questo documento contribuirà notevolmente a dipanare i meccanismi del metabolismo del DNA in futuro.

Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.
L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale principalmente dipende dallo sviluppo di rilevazione della fluorescenza e sonde fluorescenti. Per uno studio di singola molecola, è importante etichettare la proteina di interesse con una sonda fluorescente adatta poiché sistemi di rilevazione di fluorescenza per la maggior parte sono commercialmente disponibili.
Le proteine fluorescenti sono comunemente usate in biologia molecolare. Tuttavia, la bassa luminosità fluorescente e la stabilità contro photobleaching limitarne l'applicazione in molti saggi di singola molecola. Punti quantici (QDot) sono piccoli emettitori di luce nanoparticelle4. A causa di loro proprietà ottiche uniche, QDot sono 10 - 20 volte più luminoso e diverse migliaia di volte più stabile di ampiamente usato organici coloranti5. Inoltre, QDot hanno un grande Stokes shift (la differenza tra la posizione dei picchi di eccitazione e di emissione)5. Così, QDot può essere utilizzato per l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini con alti rapporti segnale-rumore, mentre essi non possono essere utilizzati in analisi quantitative.
Ad oggi, ci sono due approcci per etichettare una proteina bersaglio con QDot site-specifically: etichettatura con l'ausilio di anticorpi primari o secondari coniugati Qdot6,7,8; o etichettatura la proteina bersaglio con QDot direttamente, che si basa sull'interazione forte tra biotina e streptavidina9,10,11,12,13. Rivestite con streptavidina QDot sono disponibili in commercio. Nel nostro recente studio, site-specifically proteine biotinilate in lievito ad alta efficienza sono stati purificati dal co-sovraespressione di BirA e proteine etichettate Avi in vivo10. Segue e ottimizzando le analisi di singola molecola14,15,16,17, abbiamo osservato le interazioni tra DNA e proteine identificate Qdot a utilizzando il livello di singola molecola TIRFM10.
Qui, abbiamo scelto la gemmazione lievito origine riconoscimento complesso (ORC), che possa in particolare riconoscono e si legano alla sequenza autonomamente replica (ARS), come la proteina di interesse. Il seguente protocollo presenta una procedura dettagliata di visualizzare l'interazione di Qdot-labeled ORC con ARS utilizzando TIRFM. La preparazione del substrato DNA site-specifically modificato, la biotinilazione di DNA, la pulizia del vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, l'Assemblea di cella di flusso e l'imaging di singola molecola sono descritti.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Store 25 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;XhoI&lt;/em&gt; enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Quick-fusion cloning kit</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda&lt;br/&gt; Packaging Extracts</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Bacterial strain LE392MP&lt;br/&gt; is included in this package.</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10013092</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>NZ-amine</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirring apparatus</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tube</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>sulfuric acid</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG&lt;br/&gt; (methoxy-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotin-PEG&lt;br/&gt; (biotin-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum sealer</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Diamond-tipped glass scribe</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Inlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td></tr><tr><td>Outlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>five minutes epoxy</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Infusion/withdrawal&lt;br/&gt; programmable pump</td><td>Harvard apparatus</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging&lt;br/&gt; splitting optics</td><td>Hamamatsu photonics K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illumination system</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;times;TIRF objective</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Quad-edge laser dichroic&lt;br/&gt; beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/&lt;br/&gt; 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Quad-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/&lt;br/&gt; 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot&lt;sub&gt;705 &lt;/sub&gt;Streptavidin Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store at 4 &amp;ordm;C, do not freeze.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, adjust pH to 7.0, and store 10 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Prepare 1 M solution using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and store 10 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.

Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiva dei fagi è stata presentata dalla PCR e confermata ordinando (Figura 1). Λ-ARS317 DNA è stato purificato dai lisati liquidi (Figura 1).
Singola molecola imaging analisi sono state effettuate sull'assetto TIRFM obiettivo-tipo (Figura 2). Identificando il biotinilati ORC con un rapporto molare di quasi 1:1 rivestite con streptavidina QDot rapidamente, con etichetta Qdot ORC è stato pompato nella cella di flusso tethered λ-ARS317. DNA è stato macchiato usando SYTOX Orange. I segnali di Qdot-labeled ORC e SYTOX-arancione-macchiato del DNA erano imaged contemporaneamente utilizzando TIRFM (Figura 3A-3 C). Per determinare la distribuzione di ORC il λ-ARS317, lo stack di imaging è stato separato in due pile: una pila di segnale del DNA e altri stack di segnale ORC come descritto al punto 6.1 (Figura 3B). Basato sulla formula, posizione (kb) = (L/lORCDNA) × 50 kb (Figura 3D), 273 associazione posizioni di ORC-Qdot705 molecole su 168 substrati DNA erano quantità analizzati. I dati hanno mostrato che ORC-Qdot705 lega appositamente sul sito ARS317 inserito con un'abbondanza ovviamente alta (Figura 3E) . Nel frattempo, ORC-Qdot705 si lega anche sulle zone ricche in AT situate nella centrale e l'estremità libera del DNA λ, che è coerenza con i risultati del precedente studio10.
L'acquisizione di immagini di alta qualità dipende dal rapporto molare di proteina e di QDOT nell'analisi d'etichettatura. QDot eccessiva può essere buono per la proteina di etichettatura di efficienza, ma possono creare rumore di fondo. Come mostrato in Figura 4, mentre etichettatura biotinilati ORC con streptavidina-rivestito QDot al rapporto molare 1:3, è aumentato il rumore di fondo. Pertanto, è fondamentale per scegliere l'appropriato rapporto molare di proteine biotinilate QDot rivestite con streptavidina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig1.jpg"> Figura 1: preparazione del substrato di DNA λ-ARS317. (A) illustrazione di λ-ARS317 costruzione. Un frammento di DNA ARS317 del cuscinetto è stato integrato nel DNA λ di ricombinazione omologa. (B) le piastre sul mezzo solido LB. Tre di loro sono stati contrassegnati con frecce nere. (C) una targa di λ-ARS317 è stata identificata usando la PCR. (sinistra) Marcatore, DNA λ nativo (al centro), (a destra) una targa di λ-ARS317. (D) depurata λ-ARS317 DNA è stato rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,6%. (sinistra) Marcatore, (middle) nativo λ (a destra) di DNA purificato λ-ARS317. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig2.jpg"> Figura 2: Panoramica schematica del obiettivo-tipo TIRF e flusso cell. Singola molecola imaging analisi sono state effettuate basata su TIRFM combinando con sistema di cella di flusso. Il nostro TIRFM è stato effettuato su un microscopio invertito con un 60 X obiettivo di olio (apertura numerica = 1,49). DNA (linea grigia) era legato il coprivetrino nella cella di flusso attraverso il legame biotina-streptavidina e allungato da un flusso da sinistra verso destra. Un legame con le proteine del DNA legato è stato indicato da un puntino rosso-ovale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig3.jpg"> Figura 3: Qdot705-etichettato ORC (rapporto molare 1:1) vincolanti per λ-ARS317. (A) DNA ORC e λ-ARS317 sono state osservate simultaneamente. (in alto) SYTOX arancio macchiato DNA era eccitato utilizzando un laser a 532 nm e osservato utilizzando la banda di trasmissione 550-613 nm del filtro passa-banda quad-band. (in basso) QDot705-ORC con etichetta era eccitato utilizzando un laser di 405 nm e osservato utilizzando la banda di trasmissione 663-743 nm del filtro passa-banda quad-band. (B) due 256 × 256 Sub-pile sono state tagliate dallo stack originale 512 × 512. (C) le immagini acquisite utilizzando 61 fotogrammi sequenziali degli stack corrispondente. (sinistra) SYTOX arancio macchiato del DNA, (middle) Qdot705-etichettato ORC, immagine unita (a destra); tre Qdot705-etichettati ORC associazione al sito di ARS317 su substrati DNA λ-ARS317 sono stati contrassegnati con frecce nere. (D) illustrazione del calcolo dell'ORC vincolante posizione sul DNA. LDNA significa che la lunghezza del DNA, LORC si intende la distanza da ORC associazione sito sul DNA a fine legata del DNA. (E) distribuzione di associazione di istogramma di ORC sul DNA λ-ARS317. Gaussiana adattano ai dati è stata indicata tramite la riga di tinta rossa. Barre di errore indicano un intervallo di confidenza del 95% sulla base di 1000 campioni bootstrap. N indica il numero di molecole ORC. Sito ARS317 inserito è stato indicato mediante una freccia nera. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig4.jpg"> Figura 4: associazione con etichetta Qdot ORC (rapporto molare di 3:1) il λ-ARS317. DNA ORC e λ-ARS317 sono stati osservati nello stesso modo come in Figura 3A. (sinistra) SYTOX arancio macchiato DNA era eccitato utilizzando un laser a 532 nm. (medio) Con etichetta QDot ORC è stato eccitato utilizzando un laser di 405 nm. immagini unite (a destra). Due associazione Qdot-labeled ORC al sito ARS317 su substrati DNA λ-ARS317 sono stati contrassegnati con frecce nere. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

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7.5K Views.  Chinese Academy of Sciences. Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Ricerca

Genetica

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biochimica

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Bioingegneria

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunologia e infezioni

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biologia

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati singola molecola di monitoraggio

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

Riepilogo

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Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots

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Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

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