Name: visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified λ dna at the single molecule level
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified Î» DNA at the Single Molecule Level at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Dr. Hasan Yardimci und Dr.Sevim Yardimci des Francis Crick Institute for Art helfen bei der Einzelmolekül-Experimente, Dr. Daniel Duzdevich von Dr. Eric C. Greene-Labor der Universität von Columbia, Dr. Yujie Sun der Peking-Universität und Dr. Chunlai Chen von Tsinghua-Universität für nützliche Diskussion. Diese Studie wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisziplinärer Innovationsteams und die Newton Advanced Fellowship (NA140085) von der Royal Society.

1. Vorbereitung des λ-ARS317 DNA-Substrat
<ol><li>DNA-Substrat Bau und Verpackung<ol>
<li>Native λ-DNA mit Hilfe Xhoverdauen ich Enzym; verstärken 543 bp DNA Fragment Lager ARS317 aus genomischer DNA des angehenden Hefe mit Primer mit 20 bp homologe Sequenzen von vorgelagerten und nachgelagerten Xhoich Enzym Website auf Lambda DNA. Addieren Sie 100 ng der Xhoich verdaut λ-DNA und 10 ng DNA-fragment, zu 10 µL der homologen Rekombination Reaktionssystem, und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Um die Rekombination λ-DNA Verpacken, 25 µL der Lambda-Verpackung-Extrakte in der Rekombination Produkt hinzufügen, und die Reaktion bei 30 ° C für 90 min inkubieren. Fügen Sie eine zusätzliche 25 µL der Lambda-Verpackung-Extrakte in das Reaktionsgefäß. Weiterhin die Reaktion bei 30 ° C für 90 min inkubieren.</li>
		<li>500 µL steriler Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) in das Reaktionssystem einfügen und durch Drehen der Röhre Kopf mehrmals vorsichtig mischen. Hinzufügen von 25 µL Chloroform, vorsichtig mischen und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>100 µL der verpackten Phagen und 100 µL der Bakterien LE392MP hinzufügen (kultiviert auf 0,8 - 1,0 mit LB-Medium mit 10 mM MgSO4hinzufügen) in einen neuen Schlauch. 15 Minuten bei 37 ° C inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL des Phagen-Bakterie Mischung in 4 mL Oftop Agar (LB-Medium + 0,7 % Agar + 10 mM MgSO4, gekühlt bis 48 ° C). Sofort durch Drehen der Röhre Kopf mehrmals mischen und auf einer vorgewärmten (37 ° C) LB-Platte Gießen.</li>
		<li>Über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren und Bildschirm der λ-ARS317 Plaque mittels PCR und Sequenzierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA-Substrat Reinigung von flüssigen Lysates11,18<ol>
<li>Wählen Sie eine Plakette in 200 µL steriler DdH2O mit 10 mM MgCl2 und 10 nM CaCl2. Mix mit 200 µL des Bakteriums LE392MP (kultivierten Übernachtung in LB-Medium), und bei 37 ° C für 15 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie die Phagen-Bakterium-Mischung in 100 mL NZCYM (10 g/L NZ-Amin, 5 g/L Hefe-Extrakt, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino Hydrolysat und 2 g/L MgSO4·7H2O) Medium und Kultur für 7 h bei 37 ° C. Fügen Sie 250 µL Chloroform in die Kultur und für weitere 10 Minuten schütteln.</li>
		<li>Übertragen Sie die Kultur in eine 200 mL Flasche. Fügen Sie 5,8 g NaCl (1 M Endkonzentration hinzu), umrühren Sie, von hand lösen und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Sammeln des Überstands in ein 200 mL-Flasche und fügen Sie 10 % PEG8000 (m/V). Rühren Sie auflösen durch magnetische rühren Apparat und inkubieren Sie auf Eis für 30 Minuten oder länger.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die Bakteriophagen auszufällen. Den überstand zu entfernen.</li>
		<li>Den Niederschlag in 2 mL Phagen Verdünnungspuffer aufzuwirbeln. In einem 15 mL-Tube übertragen Sie und 10 µL RNase (Endkonzentration ist 20 µg/mL) und 40 µL DNase (Endkonzentration ist 5 µg/mL). Bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25 % SDS, 15 µL Proteinase K (Endkonzentration ist 10 µg/mL). Bei 65 ° C für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL vorgekühlte Kalium Acetat (3 M, pH 4,8) und inkubieren Sie den Schlauch für 10 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die unlöslichen Materialien zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 0,7 X Volumen von Isopropanol in der Überstand. Durch Drehen des Rohres Kopf mehrmals mischen und 2 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 10 min bei RT, DNA auszufällen. Den überstand zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die DNA, einmal mit 70 % Ethanol durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min. Überstands entfernen.</li>
		<li>Eluieren der DNS mit 500 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0) sanft, und übertragen Sie die DNA in 1,5 mL-Tube.</li>
		<li>Extrahieren Sie die DNA zweimal mit Phenol: Chloroform durch Zentrifugation bei 8.000 g für 10 Minuten.</li>
		<li>Niederschlag mit 0,7 X Volumen Isopropanol. Durch Drehen der Tube auf den Kopf sanft nach unten und bei 8.000 x g für 10 min zentrifugieren mischen.</li>
		<li>Einmal waschen mit 70 % Ethanol, in 200 µL TE aufzuwirbeln. Die DNA-Konzentration zu messen und bei-20 ° C in 12,5 µg Aliquote speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA-Biotinylierungen
<ol><li>Zu phosphorylieren biotinylierte Oligonukleotide (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3 ") ergänzen das linke Ende der Native λ DNA, hinzufügen 1 µL (100 µM) von Oligonukleotiden, 7,5 µL DdH2O, 1 µL 10-fach Ligase Puffer und 0,5 µL T4 PNK. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 3 h.</li>
	<li>Zu phosphorylieren λ-ARS317, fügen Sie 12,5 µg des λ-ARS317, 3 µL 10-fach Ligase Puffer, 1 µL T4 PNK und DdH2O Gesamtvolumen von 30 µL. brüten die Reaktion bei 37 ° C für 3 h.</li>
	<li>Um Oligonukleotide mit λ-ARS317 glühen, fügen Sie 0,5 µL phosphorylierten Oligonukleotide, 195 µL DdH2O, 25 µL 10 × Ligase Puffer in der phosphorylierten λ-ARS317 Rohr. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Rohr auf den Kopf drehen und inkubieren Sie bei 65 ° C für 5 min. Drehen Sie den Block Heizung und lassen Sie die Probe auf Abkühlen unter 33 ° C im Block.</li>
	<li>Um Oligonukleotide mit λ-ARS317 verbinden, fügen Sie 1 µL T4 DNA-Ligase und 0,63 µL von ATP (200 mM). Durch das Rohr auf den Kopf drehen vorsichtig mischen und über Nacht bei Raumtemperatur für 2 h oder 4 ° C inkubieren. Lagerung bei 4 ° C für 1 Monat. Hinweis: Um zu vermeiden, die DNA aufbrechen, sollten die Rührschüssel Schritte erfolgen durch sanft das Rohr auf den Kopf drehen, statt der Vermischung mit Pipetten.</li>
</ol>3. Deckglas Reinigung und Funktionalisierung
<ol><li>Deckglas Reinigung<ol>
<li>Platz 20 Deckgläsern in 4 färbeküvetten (5 Deckgläsern/Jar), für 30 Minuten in Ethanol beschallen und Deckgläsern mit hochreinen H2O 3 Mal spülen.</li>
		<li>Für 30 Minuten mit 1 M Kalilauge (KOH) Beschallen Sie, und spülen Sie die Deckgläsern mit hochreinen H2O 3 Mal. Wiederholen Sie Ethanol und KOH Beschallung einmal.</li>
		<li>Beschallen Sie mit Aceton für 30 Minuten und dann gründlich mit hochreinen H2O (mindestens 3 mal). Hinweis: Aceton muss entfernt werden gründlich durch das ausspülen mit hochreinen H2O, weil es eine Explosion verursachen, wenn organische Lösungsmittel (wie Aceton) fälschlicherweise mit der Piranha-Lösung gemischt14.</li>
		<li>Legen Sie die Deckgläsern in Piranha-Lösung (3:1-Mischung aus H2SO4 und 30 % H2O2) und inkubieren Sie bei 95 ° C für 1 h. Hinweis: Piranha Lösung ist sehr energisch und erosive, also mit Vorsicht verwenden. Beim Piranha Lösung vorbereiten, 50 mL von H2O2 zuerst in einen 500-mL-Becherglas hinzufügen, und fügen Sie dann 150 mL H2SO4 langsam in das Becherglas.</li>
		<li>Spülen Sie die Deckgläsern mit hochreinen H2O 5 Mal. Dann waschen Sie jede Deckglas mit hochreinen H2O 3 Becher gefüllt mit hochreinen H2O gründlich mit und trocknen Sie das Deckglas mit Papier vom Rand des Deckglases. Das Deckglas in der Färbung Glas legen und das Deckglas gründlich in einem 110 ° C Ofen für 30 Minuten trocknen.<ol>
<li>Spülen Sie das Deckglas mit Methanol und legen Sie die Färbung Glas in den 110 ° C Backofen wieder auf das Deckglas gründlich trocknen. Hinweis: Das Deckglas gründlich trocknen ist sehr wichtig, weil APTES haben viele möglichen Oberflächenstrukturen, sobald es in Gegenwart von Wasser19ist.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deckglas Funktionalisierung<ol>
<li>70 mL Silan-Lösung hinzufügen (93 % Methanol, 5 % Essigsäure und 2 % APTES) in jedes Glas, Schrauben Sie die Kappe und lassen das Glas bei Raumtemperatur über Nacht.</li>
		<li>Waschen und Trocknen der Deckgläsern, wie unter Schritt 3.1.5, außer die Deckgläsern gründlich mit Stickstoffgas anstatt sie im Ofen trocknen.</li>
		<li>150 mg mPEG (Methoxy Polyethylenglykol) und 6 mg Biotin-PEG (Biotin-Polyethylenglykol) in 1 mL der 0,1 M frisch gekochten Nahco33 (pH 8,2) gründlich auflösen. Dann Zentrifuge mit 17, 000 X g für 1 min um unlösliche Stöpsel entfernen. Hinweis: Frisch zubereitete Nahco33 ist fertig. Es gibt keine Notwendigkeit, den pH-Wert zu justieren.</li>
		<li>Die silanisiert Deckgläsern in Boxen, legen Sie und zwei kleine Deckgläsern oben auf beiden Enden des silanisiert Deckgläsern. Pipette 100 µL der PEG-Lösung in der Mitte des silanisiert Deckglas, und oben ein weiteres silanisiert deckgläschen auflegen.</li>
		<li>Fügen Sie einige ultrapure H2O im Feld um es feucht zu halten und inkubieren Sie Deckgläsern mit PEG-Lösung für mindestens 3 Stunden im Dunkeln. Eine Inkubation über Nacht kann so gut funktionieren.</li>
		<li>Trennen Sie Deckglas Paare halten Sie die funktionalisierten Oberflächen Gesicht mit, spülen Sie die Deckgläsern mit hochreinen H2O ausführlich und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas.</li>
		<li>Markieren Sie die funktionalisierten Seite von Deckgläsern auf eine der Ecken mit einem Filzstift, halten die funktionalisierten Seite aufgedeckt, legen Sie sie in Kisten und speichern die Felder im Vakuum Exsikkator für 1 Monat.</li>
		<li>Um den Deckgläsern für eine längere Zeit zu speichern, legen Sie ein Deckglas in ein 50 mL-Tube gebohrt mit einem Loch auf seine Kappe, dann habe das Rohr in eine Plastiktüte und verschließen der Tasche mit einem Vakuumiergerät. Auf diese Weise können die Deckgläsern bei-20 ° C ca. 3 Monate gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Zelle Fließmontage
<ol><li>Schneiden Sie einen 15 mm × 2 mm Kanal in der Mitte ein Stück doppelseitiges Klebeband (30 mm × 12 mm) mit einem Puncher.</li>
	<li>Die Papierseite des doppelseitigen Klebebandes ziehen Sie ab und fügen Sie ihn auf dem Objektträger mit zwei Löchern. Drücken Sie, um Luftblasen zu entfernen. Basierend auf unserer Erfahrung, ist es einfacher, die Luftblasen zu entfernen, durch die Papierseite als die Kunststoffteile auf der Seite des doppelseitigen Klebebandes abziehen.</li>
	<li>Schneiden Sie ein funktionalisierten Deckglas (60 mm × 24 mm) in vier Stücke (30 mm × 12 mm) mit einem Glas diamantbestückte scribe, und entfernen Sie den Schmutz mit Stickstoffgas. Beachten Sie, dass die funktionalisierten Seite nach oben.</li>
	<li>Die Kunststoffteile auf der Seite des doppelseitigen Klebebandes ziehen Sie ab, und fügen Sie die Folie auf die funktionalisierten Deckglas. Drücken Sie sanft, um Luftblasen zwischen dem Deckglas und das Band zu entfernen. Entfernen von Luftblasen gründlich Schütze die Durchflusszelle Austritt während Puffer gepumpt wurden.</li>
	<li>Legen Sie Einlass und Auslass-Schlauch bzw. in kleine und große Löcher. Befestigen Sie den Schlauch mit Epoxy.</li>
	<li>20 µL Streptavidin (0,2 mg/mL) in die Messzelle mit einer Spritze manuell Pumpen und 10 min bei RT inkubieren. Dann Pumpen Sie blockierende Puffer10 in Durchflusszelle Streptavidin ersetzen, und bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
</ol>5. Einzelmolekül-Visualisierung
<ol><li>Erhalten Sie die fokale Ausrichtung der rot-dunkelrote mit A5 auf der Fluoreszenz-Mikroskop Test Folie #1 durch gleichzeitige Erregung mit 532 nm Laser und 640 nm Laser. Dual Wellenlänge Bilder mit Aufteilung der Optik (siehe Tabelle der Materialien) zu produzieren.</li>
	<li>Das Mikroskop setzen Sie die Durchflusszelle auf und schließen Sie ihre Auslass-Schlauch an eine längere Schläuche anschließen mit einer 10 mL-Feder auf einer automatischen Aufguss/Rücktritt programmierbaren Pumpe installiert. Hinweis: Pumpen Puffer in der Messzelle unter bedeutet Rückzug Puffer aus den Zulauf-Schlauch der Durchflusszelle an der Spritze erwähnt.</li>
	<li>Pumpen Sie blockierende Puffer mit 500 µL/min in der Durchflusszelle Luft schnell entfernen und sicherstellen, dass der Puffer in der Messzelle entsperrt ist. Dann Pumpen des blockierenden Puffers mit 200 µL/min in der Messzelle und drehen Sie den Ausgang Schlauch um Luftblasen aus den Zulauf-Schlauch und die Durchflusszelle gründlich zu entfernen. Hinweis: Alle Puffer in der Messzelle gepumpt sollte für mindestens 15 Minuten vor dem Gebrauch in einem Vakuum Exsikkator entgast werden.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 µL biotinylierte λ-ARS317 DNA in 80 µL blocking-Puffer, und in der Messzelle mit 25 µL/min 2 min Pumpen. Λ-ARS317 DNA mit 200 µL blocking-Puffer mit einer Rate von 50 µL/min, dann bündig.</li>
	<li>Pump 200 µL Puffer10 zu binden, mit einer Rate von 50 µL/min, den blocking-Puffer in der Messzelle zu entfernen.</li>
	<li>Hinzufügen von 0,2 µL Streptavidin beschichteten Qdot705 (1 µM) und 0,2 µL biotinylierte ORC (1,2 µM) in ein Gefäß und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dann fügen Sie 20 µL Puffer in das Rohr zu binden, und legen Sie ihn auf Eis. Die Endkonzentration von ORC-Qdot705 ist etwa 10 nM.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL der ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL von DVB-t (100 mM), 1 µL von ATP (200 mM) in 96 µL Bindung Puffer. Die Endkonzentration von ORC-Qdot705 ist 0,2 nM.</li>
	<li>Pumpen Sie 20 µL 0,2 nM ORC-Qdot705 mit einer Rate von 10 µL/min in der Messzelle. Der übermäßige ORC-Qdot705 mit 200 µL Puffer Bindung mit einer Rate von 100 µL/min spülen. Dann Pumpen Sie Bindung Puffer mit 30 nM SYTOX Orange in der Messzelle, DNA-Substrate mit einer Rate von 100 µL/min zu beflecken.</li>
	<li>Das ORC-Qdot-705 -Signal begeistern und SYTOX Orange gefärbten DNA-Signal mit einem 405 nm-Laser und 532 nm Laser, beziehungsweise. Beobachten Sie die Signale gleichzeitig mit 100 µL/min-Fluss mit einem Quad-Band-Bandpass-Filter (FF01-446/510/581/703-25) und zeichnen Sie die Bilder vom EM-CCD mit 100 ms pro Frame. Sammeln Sie 20 Bild-Stacks aus verschiedenen Bereichen.</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Zuschneiden der Bilder mit dem Fidschi-Software mit einer neuen Plugin, welches von uns geändert wird auf der Image-Plugin (OI_cut_RGBmerge basiert) von Dr. Ron Vale Lab an der University of California, San Francisco entwickelt.<ol>
<li>Schneiden Sie einen Stapel von Bildern (512 × 512 Pixel) in zwei Stapel von Bildern (256 × 256 Pixel). Einer ist ein 532 nm laser-spannendes Ergebnis, und das andere ist ein 405 nm laser-spannenden Ergebnis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verarbeiten Sie 61 aufeinander folgenden Bildern mit Fidschi-Bild-Stapel-Z-Projekt (mittlere Intensität).</li>
	<li>Messen Sie die Länge der DNA (LDNA) und der Abstand von der Website des ORC-Qdot705 (LORC) Bindung an DNA an der DNS angebunden Ende manuell.</li>
	<li>Berechnet das Ergebnis LORC/lDNA mit excel, analysieren Sie die Daten mithilfe der bootstrap-Methode von R, dann das Histogramm zu erstellen und Gaußsche Verteilungen zu passen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria.">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li><li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots:+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors.">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots.">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA.">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li><li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot.">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li><li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system.">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li><li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level.">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).</li><li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation:+origin+specificity,+licensing,+and+firing+at+the+single-molecule+level.">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li><li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes.">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies.">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li><li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-molecule+approach+to+visualize+the+nucleosome+assembly+in+yeast+nucleoplasmic+extracts.">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li><li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li><li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+&#955;+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates.">A bacteriophage &#955; DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li><li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes.">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li><li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und die ortspezifisch modifizierte λ-DNA mit Hilfe der TIRFM in einer Durchflusszelle beobachten. Die notwendigen Schritte sind standortspezifische Modifikation der DNA Substrat, DNA biotinylierungen Deckglas Reinigung und Funktionalisierung, Durchflusszelle Vorbereitung und Einzelmolekül-Bildgebung. Es gibt zwei wichtige Punkte, die beachtet werden sollten. Zunächst werden alle Schritte mit λ-DNA sanft manipuliert werden sollten, um mögliche Schäden, z.B.zu verringern durch pipettieren immer wieder rauf und runter mischen zu vermeiden. Zweitens ist es sehr wichtig sicherzustellen, dass das Deckglas sauber genug ist, um die Hintergrundgeräusche zu minimieren. Während des Deckglases Reinigung und Funktionalisierung, sollte Wasser Reinstwasser Niveau erreichen, und die Luft sollte staubfrei. Es ist besser, das Deckglas Funktionalisierung und Durchflusszelle Montage auf einer sauberen Werkbank durchführen.
In der Einzelmolekül-Assays für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktion ist λ-DNA eine geeignete Substrat mit mehrere Vorteile20. Λ-DNA ist lang genug, um leicht beobachtet werden und erlauben die Aufnahme von Protein Bewegung darauf in einem einzigen Molekül-Experiment. Darüber hinaus erlauben die SsDNA Überhänge viele Entwürfe für tethering λ-DNA auf einem Glas deckgläschen. In dieser Studie stellen wir eine Methode für das Einfügen einer exogene DNA-Fragment an einem bestimmten Standort der λ-DNA. So können verschiedene benutzerdefinierbare DNA-Fragmente in λ-DNA integriert werden. Die modifizierte λ-DNA kann bequem vom flüssigen Lysates in großen Mengen für die Einzelmolekül-Studie gereinigt werden.
Es ist schwer zu beurteilen die Kennzeichnung Effizienz genau in die Streptavidin beschichteten Qdot Assay bezeichnen, denn es etwa 5 bis 10 Streptavidins pro Qdot Nanocrystal gibt. Dementsprechend sollte die entsprechende Molverhältnis von Streptavidin beschichteten Qdots und biotinylierte Proteine in den Experimenten optimiert werden. Einem Molverhältnis von 1:1 kann ein Verweis sein.
Anzumerken ist, dass Qdot in genaue quantitative Tests verwendet werden kann, da seine hohe Lichtstabilität ungeeignet für die Foto-bleichen-Assay ist. Obwohl die hohe Stabilität der Qdots ihre Anwendung in der quantitativen Assays einschränkt, ermöglicht es, einfache Beobachtung und Langzeit Tracking-5. Mit zunehmender Anwendungen der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie in der Biologie das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen wird wesentlich zur Entschlüsselung der Mechanismen der DNA-Stoffwechsel in Zukunft beitragen.

Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA sind entscheidend für viele komplexe biologische Prozesse, wie DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Transkription. Obwohl konventionelle Ansätze die Eigenschaften dieser Prozesse beleuchten haben, sind viele wichtige Mechanismen noch unklar. Vor kurzem, wurden einige der Mechanismen, mit den sich rasch entwickelnden Einzelmolekül-Techniken, adressierte1,2,3.
Die Anwendung der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie auf DNA-Protein Interaktionen in Echtzeit vor allem Visualisierung hängt von der Entwicklung der Fluoreszenz-Detektion und fluoreszierende Sonden. Für ein einzelnes Molekül-Studie ist es wichtig, mit einer geeigneten fluoreszierende Sonde Proteins des Interesses zu kennzeichnen, da Fluoreszenz-Detection-Systeme meist im Handel erhältlich sind.
Fluoreszierende Proteine werden häufig in der Molekularbiologie verwendet. Jedoch beschränken die niedrige fluoreszierende Helligkeit und Stabilität gegen Immunofluoreszenz ihre Anwendung in vielen Einzelmolekül-Assays. Quantenpunkte (Qdots) sind winzige Leuchtdioden Nanopartikel4. Aufgrund ihrer einzigartigen optischen Eigenschaften Qdots sind 10 - 20 mal heller und mehrere tausend Mal stabiler als die verbreitete organische Farbstoffe5. Darüber hinaus haben Qdots eine große Stokes Shift (die Differenz zwischen der Position der Anregung und Emission Gipfel)5. So kann Qdots verwendet werden, für langjährige Beobachtung (Minuten bis Stunden) und Aufnahme von Bildern mit hohen Signal-Rausch-Verhältnis, während sie in der quantitativen Assays verwendet werden können.
Bisher gibt es zwei Ansätze, ein Zielprotein mit Qdots ortspezifisch zu kennzeichnen: Kennzeichnung mit Hilfe von Qdot konjugiert primäre oder sekundäre Antikörper6,7,8; oder das Zielprotein mit Qdots direkt, die basiert auf der starken Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin9,10,11,12,13Kennzeichnung. Streptavidin-beschichteten Qdots sind im Handel erhältlich. In unserer aktuellen Studie ortspezifisch biotinylierte Proteine in der angehenden Hefe mit hohem Wirkungsgrad durch co-Überexpression von BirA und Avi-markierten Proteinen gereinigt wurden in Vivo10. Durch die folgenden und Optimierung der Einzelmolekül-Assays14,15,16,17beobachteten wir die Wechselwirkungen zwischen Qdot-markierten Proteinen und DNA Einzelmolekül Ebene mit TIRFM10.
Hier wählen wir die angehenden Hefe Herkunft Anerkennung Komplex (ORC), die spezifisch erkennen und Binden an die autonom replizierende Sequenz (ARS), als unser Protein des Interesses. Das folgende Protokoll stellt eine schrittweise Anleitung zur Visualisierung der Interaktion des Qdot-Label ORKS mit ARS mit TIRFM. Die Herstellung der ortspezifisch modifizierte DNA Substrat, die DNA-biotinylierungen, Deckglas Reinigung und Funktionalisierung, Durchflusszelle Versammlung und der Einzelmolekül-Bildgebung sind beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Store 25 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;XhoI&lt;/em&gt; enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Quick-fusion cloning kit</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda&lt;br/&gt; Packaging Extracts</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Bacterial strain LE392MP&lt;br/&gt; is included in this package.</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10013092</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>NZ-amine</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirring apparatus</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tube</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>sulfuric acid</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG&lt;br/&gt; (methoxy-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotin-PEG&lt;br/&gt; (biotin-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum sealer</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Diamond-tipped glass scribe</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Inlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td></tr><tr><td>Outlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>five minutes epoxy</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Infusion/withdrawal&lt;br/&gt; programmable pump</td><td>Harvard apparatus</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging&lt;br/&gt; splitting optics</td><td>Hamamatsu photonics K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illumination system</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;times;TIRF objective</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Quad-edge laser dichroic&lt;br/&gt; beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/&lt;br/&gt; 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Quad-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/&lt;br/&gt; 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot&lt;sub&gt;705 &lt;/sub&gt;Streptavidin Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store at 4 &amp;ordm;C, do not freeze.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, adjust pH to 7.0, and store 10 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Prepare 1 M solution using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and store 10 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

Die Fluoreszenz-Mikroskopie hat große Beiträge geleistet, in die Mechanismen der komplexe biologische Prozesse auf der Ebene des einzelnen Moleküls sezieren. In Einzelmolekül-Assays für die DNA-Protein Interaktionen zu studieren, gibt es zwei wichtige Faktoren für die Prüfung: die DNA-Substrat mit genügend Länge für einfache Beobachtung und Kennzeichnung ein Protein mit einer geeigneten fluoreszierende Sonde. 48,5 kb λ-DNA ist ein guter Kandidat für die DNA-Substrat. Quantenpunkte (Qdots), können als eine Klasse von fluoreszierenden Sonden, langjähriger Beobachtung (Minuten bis Stunden) und qualitativ hochwertige Bilderfassung. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll, um DNA-Protein Interaktionen Ebene der Einzelmolekül-Studie umfasst eine ortspezifisch modifizierte λ DNA Vorbereitung und Kennzeichnung ein Zielprotein mit Streptavidin-beschichteten Qdots. Für ein Proof of Concept wir wählen Sie ORC (Herkunft Erkennung komplexer) in angehende Hefe als ein Protein des Interesses und seiner Interaktion mit einer ARS (autonom replizierende Sequenz) mit TIRFM zu visualisieren. Im Vergleich mit anderen fluoreszierenden Sonden, Qdots haben offensichtliche Vorteile in Einzelmolekül-Studien aufgrund seiner hohen Stabilität gegen Immunofluoreszenz, aber es sei darauf hingewiesen, dass diese Eigenschaft die Anwendung in der quantitativen Assays schränkt.

Um die Interaktion zwischen ORC Qdot beschriftet und die ARS zu visualisieren, errichteten wir zuerst das λ-ARS317 DNA-Substrat. Ein DNA-Fragment mit ARS317 wurde integriert in XhoI Seite (33,5 kb) der native λ-DNA durch homologe Rekombination (Abbildung 1A). Die Rekombination Produkt wurde verpackt mit Extrakten und die verpackten Phagen Partikel auf LB-Platten (Abbildung 1 b) kultiviert wurden. Die positive Phagen-Plaque wurde mittels PCR überprüft und bestätigt durch Sequenzierung (Abbildung 1). Λ-ARS317 DNA wurde gereinigt von der flüssigen Lysaten (Abbildung 1).
Einzelmolekül-bildgebende Untersuchungen erfolgten am Ziel-Typ TIRFM Setup (Abbildung 2). Durch Kennzeichnung der biotinylierte Ork mit einem molaren Verhältnis von fast 1:1 Streptavidin beschichteten Qdots schnell, Qdot-Label ORC wurde in der λ-ARS317 gefesselte Messzelle gepumpt. DNA wurde mit SYTOX Orange gefärbt. Die Signale des Qdot beschriftet ORC und SYTOX-Orange gefärbten DNA wurden gleichzeitig mit TIRFM (Abb. 3A-3 C) abgebildet. Um die Verteilung der Ork auf λ-ARS317 zu bestimmen, trennte sich der bildgebende Stapel in zwei Stapel: ein Stapel von DNA-Signal und die anderen Stapel von ORC-Signal wie in Schritt 6.1 (Abb. 3 b) beschrieben. Basierend auf der Formel, Position (kb) = (L/lORCDNA) × 50 kb (Abbildung 3D), 273 verbindlich Positionen der ORC-Qdot705 Moleküle auf 168 DNA-Substrate sind quantitativ analysiert. Die Daten zeigten, dass ORC-Qdot705 speziell bindetauf der ARS317 eingefügt-Website mit einer hohen Fülle (Abbildung 3E). ORC-Qdot705 bindet inzwischen auch auf die AT-reichen Gebieten befindet sich in der Mitte und das freie Ende des λ-DNA, die im Einklang mit den Ergebnissen der vorherigen Studie10.
Die qualitativ hochwertige Bildaufnahme hängt das molare Verhältnis von Eiweiß und Qdots in der Kennzeichnung Test. Übermäßige Qdots kann gut sein für das Protein Kennzeichnung Effizienz, aber sie können Hintergrundgeräusche erstellen. Wie in Abbildung 4dargestellt, während der Etikettierung der biotinylierte Ork mit Streptavidin beschichteten Qdots im Molverhältnis 1:3, erhöht die Geräuschkulisse. Daher ist es wichtig, die entsprechenden Molverhältnis biotinylierte Proteine zu Streptavidin beschichteten Qdots wählen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig1.jpg"> Abbildung 1: Vorbereitung der λ-ARS317 DNA Substrat. (A) Abbildung der λ-ARS317 Konstruktion. Ein DNA-Fragment mit ARS317 wurde durch homologe Rekombination λ-DNA integriert. (B) Plaques auf festem Medium LB. Drei von ihnen wurden mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. (C) eine λ-ARS317-Gedenktafel wurde mittels PCR identifiziert. (links) Marker, (Mitte) native λ-DNA, (rechts) eine Gedenktafel der λ-ARS317. (D) Purified λ-ARS317 DNA wurde von 0,6 % Agarose-Gelelektrophorese erkannt. (links) Marker, gereinigt (Mitte) native λ DNA (rechts) λ-ARS317. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Übersicht über Ziel-Typ TIRF und Flow Cell. Einzelmolekül bildgebende Tests wurden anhand der TIRFM kombiniert mit Flow-Zelle-System durchgeführt. Unsere TIRFM erfolgte auf einem inversen Mikroskop, ausgestattet mit einem 60 X Öl Ziel (numerische Apertur = 1.49). DNA (graue Linie) wurde auf das Deckglas in der Messzelle durch die Verknüpfung von Biotin-Streptavidin angebunden und erstreckte sich von der Strömung von links nach rechts. Eine Proteinbindung auf die gefesselte DNA wurde durch einen rot-Oval-Punkt angegeben. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig3.jpg"> Abbildung 3: Qdot705-ORC (Molares Verhältnis 1:1) verbindlich auf λ-ARS317 beschriftet. (A) ORC und λ-ARS317 DNA wurden gleichzeitig beobachtet. (oben) SYTOX Orange gefärbten DNA begeistert mit 532 nm Laser und beobachtet die 550-613 nm Getriebe Band Quadband-Bandpass-Filter nutzen. (unten) Qdot705-beschrifteten ORC war aufgeregt mit einem 405 nm-Laser und beobachtet die 663-743 nm Getriebe Band Quadband-Bandpass-Filter nutzen. (B) zwei 256 × 256 Sub Stapel wurden aus dem ursprünglichen 512 × 512 Stapel abgeschnitten. (C) der Bilder aufgenommen mit 61 sequenzielle Rahmen in den entsprechenden Stapel. (links) SYTOX Orange gefärbten DNA, (mittlere) Qdot705-beschriftet ORC, zusammengeführte Bild (rechts); drei Qdot705-beschrifteten ORC-Bindung an ARS317 Stelle auf λ-ARS317 DNA-Substrate wurden mit schwarzen Pfeilen markiert. (D) Illustration der Berechnung des ORC verbindliche Stellungnahme DNA. LDNA bedeutet die DNA-Länge, LORC bedeutet die Entfernung von ORC Website auf DNA an gefesselte Ende der DNA binden. (E) Histogramm der ORC verbindliche Verteilung auf λ-ARS317 DNA. Gauß an die Daten anpassen wurde durch die rote durchgezogene Linie angezeigt. Fehlerbalken zeigen eine 95 %-Konfidenzintervall auf 1000 bootstrap-Stichproben beruhen. N bedeutet die Anzahl der ORC-Moleküle. ARS317 eingefügt-Website wurde durch ein schwarzer Pfeil angezeigt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57967/57967fig4.jpg"> Abbildung 4: Qdot-Label ORC (molaren Verhältnis 3:1) bindend λ-ARS317. ORC und λ-ARS317 DNA wurden in der gleichen Weise wie in Abbildung 3Abeobachtet. (links) SYTOX Orange gefärbten DNA mit 532 nm Laser angeregt wurde. (Mitte) Qdot-Label ORC war begeistert mit einem 405 nm-Laser. (rechts) zusammengeführten Bilder. Zwei Qdot-Label ORC-Bindung an ARS317 Stelle auf λ-ARS317 DNA-Substrate wurden mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57967/57967fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified Î» DNA at the Single Molecule Level at JoVE.com

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur DNA-Protein Interaktionen durch Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) mit ein ortspezifisch modifizierte λ-DNA-Substrat und einem Quantenpunkt beschriftet Protein zu studieren.

Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K Aufrufe.  Chinese Academy of Sciences. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur DNA-Protein Interaktionen durch Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) mit ein ortspezifisch modifizierte λ-DNA-Substrat und einem Quantenpunkt beschriftet Protein zu studieren.

Serie: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Forschung

Genetik

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biochemie

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Biotechnik

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunologie und Infektion

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biologie

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...