Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal Monash University, National Health Medical Research Council e del polmone Monash e sonno Institute. Gli autori vorrei ringraziare lo staff di immunologia clinica presso Monash salute, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo di Monash Micro Imaging (MMI) per aiuto con la formazione immagine di microscopia confocale, e gli autori riconoscono le strutture MMI della Monash University. Gli autori riconoscono le strutture e assistenza scientifica e tecnica della piattaforma istologia Monash.

questo protocollo segue esperimenti approvati: (1) gli esseri umani dal comitato etico del Monash Medical Centre e (2) animali dal comitato etico dell'Università di Melbourne.
 1. lavaggio broncoalveolare (BAL) macrofagi <ol><li>BAL di uso per ottenere i macrofagi del polmone in: (1) umani soggetti di broncoscopia 6 e (2) topi mediante aspirazione endotracheale 13 . 
	Nota: Acquisizione dei macrofagi causa generalmente alcuni attivazione di queste cellule. I macrofagi sono ottenuti da pazienti che richiedono una broncoscopia per indagare un potenziale problema medico e non tutti i soggetti possono essere adatti per l'analisi dei METs (questo dovrà essere determinata per ogni singolo progetto).
	<ol><li>Prendere la soluzione BAL e spin-down (500 x g per 10 min) per formare una pallina, lavare due volte con terreno di coltura (Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) con 5% di siero fetale di vitello e 1% L-Glutammina) a temperatura ambiente e poi diluire le cellule in 4 mL di cultura medi um.</li>
		<li>Se necessario, richiedere una formale conteggio differenziale; la maggior parte delle cellule (generalmente &#62; 80%) sarà macrofagi 6. 
		Nota: Questo in genere viene eseguito da un servizio di istologia clinica utilizzando l'aspetto morfologico delle cellule differenti tipi 6.</li>
		<li>Eseguire una cellula macrofagica praticabile contare sulla soluzione BAL utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro. 
		Nota: Soluzione di BAL è ottenuta dagli esseri umani e topi come indicato al punto 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 macrofagi a 24 pozzetti sulle lamelle in 500 µ l di terreno di coltura per bene e lasciare tutta la notte a 37 ° C; le cellule si atterranno alle lamelle. Per campioni umani, aggiungere antibiotici (ad es., penicillina e streptomicina, 10 4 U/mL) per prevenire la contaminazione batterica.</li>
	</ol></li></ol> 2. Etichettatura/microscopia di immunofluorescenza dei macrofagi BAL Nota: cellule siano rispettate su vetrini coprioggetti, come accennato in precedenza.
<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS). Difficoltà cellule nel fissativo di paraformaldeide/periodato/lisina (PLP) del 2% per un minimo di 10</li>
	<li>Lavare le cellule brevemente in PBS e quindi permeabilize in 0,2% Tween 20 in PBS per 20 min.</li>
	<li>Cellule di blocco con i sieri di pollo 10% a 5% albumina di siero bovino (BSA) diluito in PBS per 30 min.</li>
	Gli anticorpi <li>incubare con controllo primario e isotype per 1 h a temperatura ambiente a concentrazioni di 1: 100 (dettagli più specifici sono elencati in Tabella materiali) a 37 ° C. 
	Nota: Per i campioni di BAL, un marcatore specifico di macrofagi di solito non è necessario.</li>
	<li>Dopo l'aggiunta di anticorpi primari, lavare le cellule in PBS e incubare ulteriormente con i corrispondenti anticorpi secondari per 40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le sezioni nel PBS e montare con il mezzo di montaggio a base DAPI per visualizzazione utilizzando un microscopio confocale (come detto sopra) al laser eccitazioni 405, 488, 561 e 647 nm e 40 X, 1,0 NA olio obiettivo.</li>
</ol> 3. Campioni di tessuto polmonare Nota: per studi in vivo del tessuto polmonare, studiare i campioni dopo l'esposizione pertinente (ad es., come descritto da O &#39; Sullivan et al. 7). l'esposizione più pertinente per questo esperimento sono microrganismi infettivi, soprattutto batteri. Diversi ceppi di topi che potrebbero essere utilizzati per questo metodo sono topi C57BL/6 o BALB/c, 10-12 settimane di età, peso 25-30 g e uomo.
<ol><li>Euthanize topi, tramite un'iniezione intraperitoneale di ketamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Aprire la cavità toracica ed esporre i polmoni e il cuore utilizzando forbici e pinze chirurgiche.
	<ol><li>Infondere PBS caldo usando un ago da 21 gauge nel ventricolo destro per lavare il sangue dai vasi per 30 s, poi infondere 10 mL di fissativo PLP di 2% per 30 s (nel ventricolo destro).</li>
		<li>Utilizzare calda PBS (42 ° C) per il lavaggio della cavità toracica aperta. Intubare la trachea con un ago da 21 gauge e un pezzo di tubo di 0,8 mm tagliato a misura e iniettare 800 µ l di pre-riscaldato (a 42 ° C), basso punto di fusione punto soluzione di agarosio 3%.</li>
		<li>Cravatta fuori la trachea con seta intrecciato (4.0 USP). Mettere il filo intorno alla trachea, appena sotto il punto di inserimento della cannula e fissarlo tramite un semplice nodo alla marinara. Per solidificare l'agarosio, amministrare ghiacciata PBS intorno ai polmoni. Rimuovere i polmoni e il cuore come un blocco dalla cavità toracica mediante dissezione smussa e forbici. Rimuovere ciascun polmone individualmente e quindi correggerli per 16 h a 2% PLP o formalina al 4 ° C.</li>
		<li>Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino al tessuto di sezionamento. Questi metodi per ottenere il tessuto del polmone sono stati descritti in precedenza 13.</li>
	</ol></li> <li>Per preparare il tessuto polmonare campioni attenersi alla seguente procedura.
	<ol><li>Fix del tessuto polmonare tessuti (resecati in fase 3.1) in 10% formalina tamponata naturale per 24 h a temperatura ambiente. Trasferimento al 75% di etanolo e messo in un processatore di tessuti su un ciclo di 12 h, (2,5 h in 75% EtOH, 3h in EtOH assoluto, 3,5 h in solvente 3B e per 3 h in paraffina).</li>
		<li>Embed in paraffina standard per creare formalina-fisse, paraffina-incastonato blocchi (FFPE) che sono immagazzinati a temperatura ambiente. 
		Nota: In questa fase, è generalmente opportuno tagliare le sezioni di polmone per diapositive standard.</li>
		<li>Tagliare le sezioni di polmone FFPE alle 4-5 µm spessore utilizzando un microtomo e montare sulla carica, come precedentemente descritti da O rivestito di diapositive &#39; Sullivan et al. 7</li> <li>per montare diapositive, mettere 3 gocce di mezzo di montaggio sulle lamelle 60 x 24 mm (misura 1,5), invertire la diapositiva il coprivetrino e spingere fuori l'eccesso del prodotto. Ermeticamente sigillare con smalto e conservare a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparazione/microscopia dei campioni di tessuto polmonare <ol><li>de-cera, reidratare e pretrattare il campione di tessuto FFPE polmonare con soluzione di smascheramento dell'antigene.
	<ol><li>Forno asciutto il FFPE diapositive per 60 min a 60 ° C. Poi mettere i vetrini nella soluzione di xilene per 30 min e trasferimento alla soluzione di etanolo 70% per 5 min a temperatura ambiente. Risciacquo in acqua di rubinetto.</li>
		<li>Posto in involucro di plastica resistente al calore e soggetti a recupero HIER-antigene in una pentola a pressione per 10 min a 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Raffreddare per 20 min. lavare due volte in acqua corrente per 5 minuti su un agitatore meccanico, poi una volta con PBS su rocker.</li>
		<li>Blocco con siero di pollo 10% a 5% BSA/PBS per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Macchiare il tessuto.
	<ol><li>Per definire METs in macrofagi, aggiungere gli anticorpi primari (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 1% BSA/PBS per 16 h a 4 ° C a diluizione 1/100 (informazioni dettagliate sulla quantità di anticorpo sono elencati in Tabella materiali). Lavare due volte con PBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.</li>
		Anticorpi di <li>raggiungere rilevazione fluorescente tramite incubazione con secondario corrispondente in 1% BSA/PBS per 40 min a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono: (1) pollo anti-mouse 488 (verde), anti-capra pollo (2) 594 (rosso) e (3) asino anti-mouse (lontano rosso) 647.</li>
		<li>Lavare le sezioni in PBS e montaggio con DAPI-contenente di mezzo di montaggio per la macchiatura della cromatina.</li>
	</ol></li> <li>Ottenere immagini fluorescenti utilizzando un laser confocale scansione testa collegata ad un microscopio invertito.
	Laser: <ol><li>Excite la preparazione con 405, 488, 561 e 647 nm. Catturare immagini a 512 x 512 pixel singolo aereo facendo clic sulla linea-sequenziale, livellamento button (2 in linea media) utilizzando 20 X 0,1 NA aria e 40 X 1.0 NA olio obiettivi.</li>
		<li>Ottenere almeno dieci campi di vista per profilato per analisi e dati per ogni risultato (vale a dire, 10 campi di vista ad alta potenza (HFOV) per il controllo, 10 per il campione stimolato, ecc., per ogni mouse). 
		Nota: Per ottenere un campione rappresentativo di tutto il campo, può essere utilizzato un sistema a matrice in cui il campo è diviso in diverse sezioni per ogni campione diversi la stessa matrice viene utilizzata per selezionare i campi di vista (ad esempio, il campo può essere diviso in 9 sezioni, e dal centro e 4 angoli, sono presi due HFOV).</li>
	</ol></li></ol> 5. Tridimensionale (3D) Imaging di METs Nota: come METs sono strutture 3-d, prendendo più z-stack di immagini, che vengono ricostituiti, possono dare informazioni preziose.
<ol><li>Sezione gli esemplari del polmone da blocchetti di paraffina, a 200 µm usando una vibratome ad un'ampiezza impostata a 1,8 mm e velocità di 0,1-0,5 mm/s.</li>
	<li>Bloccare tessuto polmonare con il 20% del rispettivo siero (10% di siero fetale di vitello e pollo 10% siero) e poi permeabilize in PBS completati e al 3,75% Triton-X100 per 7 h a temperatura ambiente sotto agitazione delicata.</li>
	<li>Macchia le sezioni per 16 h a 4 ° C con gli anticorpi primari pertinenti (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 200 volumi di µ l in microcentrifuga (concentrazioni anticorpali sono elencate in Tabella materiali).</li>
	<li>Lavare le sezioni in PBS, 3 volte per 10 min prima incubazione con gli anticorpi secondari pertinenti a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Macchia le sezioni del polmone per DAPI (1:5, 000) in soluzione per 20 minuti, prima di aggiungere i vetrini al microscopio le diapositive in PBS.</li>
	<li>Ottenere immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale invertito (40 x 1.3 NA) dotato di 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm laser.</li>
	<li>Registrare 3D z-pile di 0,54 µm spessore con z-sezionamento ottimo per l'obiettivo di olio NA 40 x 1.3. 
	Nota: Il software utilizzato variano a seconda il microscopio individuo. Un esempio di come il software può essere utilizzato per uno microscopio viene fornito in File supplementari 1.</li>
</ol> 6. Analisi dell'immagine Nota: l'analisi dei campioni richiede l'utilizzo di specifici software di analisi di imaging ed esempi sono elencati nella Tabella materiali. Mentre l'analisi dei risultati dipenderà il programma specifico utilizzato, i punti elencati qui sotto sono importanti.
<ol><li>Campioni di analisi di BAL <ol><li>definire il numero di macrofagi selezionando il canale blu per DAPI e assegnando una dimensione minima per le celle (ad es., &#62; 18 µm di diametro). Misurare con il relativo software, il numero totale dei macrofagi per ogni campo.</li>
		<li>Contare il numero di cellule che hanno le caratteristiche di un MET dalla presenza di cromatina extracellulare rilevata da DAPI con co-espressione di altri marcatori (ad es., MMP12, PAD2 e H3Cit). 
		Nota: Il numero di marcatori che possono essere analizzati dipende dal numero di laser disponibili, ma idealmente oltre DAPI, almeno due altri indicatori dovrebbero essere inclusi. Altri meno parametri specifici per espressione di MET (ad es., numero di cellule con cromatina extracellulare e un nucleo allargato) può essere utilizzato.</li>
		<li>Per confrontare l'espressione di MET in BAL campioni (tra il controllo, fumo e fumo/dnasi trattata gruppi), analizzare un minimo di 100 macrofagi BAL per esempio.</li>
		<li>Per misurare anticorpo secondario e isotype controllare i livelli di fluorescenza; misurare un minimo di 100 cellule in ogni campione per loro fluorescenza. Misurare il livello medio di fluorescenza di fondo per ogni indicatore (ad esempio, H3Cit) utilizzando software standard.</li>
		<li>Per definire l'espressione di MET, contare le cellule con il fenotipo tipico (ad es., cromatina extracellulare con co-espressione di H3Cit e MMP9) e per ogni MET, misurare il livello di fluorescenza degli indicatori (ad es., H3Cit e MMP9). Escludere le cellule che producono METs se loro colorazione non era sopra controllo di sfondo e isotype.</li>
		<li>Per campioni umani di BAL, analizzare un minimo di 100 celle per ogni campione per la percentuale dei macrofagi che rendono METs. Per esempi di murini, come le cellule sono più piccole e METs sono più difficili da definire, analizzare un numero maggiore di celle per ogni campione (ad es., 200 macrofagi).</li>
	</ol></li> <li>Analisi dei campioni di tessuto polmonare <ol><li>per determinare la presenza di METs nel tessuto polmonare, utilizzare indicatore specifico del macrofago come F4/80.</li>
		<li>Definire la presenza di METs nel tessuto polmonare utilizzando la co-localizzazione di F4/80 in cellule che esprimono extracellulare della cromatina con altri parametri, come indicato nella sezione 6.1.</li>
		<li>Determinare i livelli di fluorescenza di fondo nei campioni con anticorpo secondario e i controlli di isotipo. METs di escludere dall'analisi che non sono sopra sfondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative per rendere in relazione a questo lavoro.

Il metodo descritto in questa recensione è basato su quello utilizzato per definire la presenza di reti14. I macrofagi sono di gran lunga il tipo di cella dominante in campioni BAL e questo metodo di raccolta è particolarmente adatto per lo studio di METs. Se i globuli rossi sono presenti nel BAL, queste cellule dovrebbero essere lisate utilizzando cloruro di ammonio. La procedura di BAL generalmente attiva i macrofagi e pertanto si prevede che ci saranno METs presenti in campioni non-stimolati. I macrofagi di BAL sono solitamente molto aderenti. I macrofagi di BAL non saranno generalmente necessario un marker specifico come queste cellule sono il tipo di cella dominante e possono anche essere distinti dalla loro morfologia. Di solito in un BAL, maggiore di 80% delle cellule sono macrofagi (e i neutrofili sono meno del 5%) e dopo diversi lavaggi, solo i leucociti aderenti (cioè, i macrofagi) rimangono generalmente6. Se non vi è dubbio circa la capacità di distinguere i macrofagi dai neutrofili in esseri umani, può essere utilizzato un marcatore del neutrofilo come elastasi del neutrofilo. Nel tessuto polmonare, un marcatore specifico del macrofago (ad es., F4/80) è richiesto come macrofagi sono difficili da distinguere da altri tipi di cellule. I macrofagi hanno auto-fluorescenza per l'utilizzo dei controlli di sfondo e isotype è importante; Questo è specialmente il caso con campioni stimolati.
Il modo migliore per definire la presenza di METs rimane essere determinato. Vie/processi specifici, che sono comuni a entrambi i neutrofili e macrofagi sono: (1) granulare proteasi, (2) citrullination di istoni e (3) PAD. PAD4 è più specifico per i neutrofili, mentre PAD2 è più prominente nei monociti/macrofagi. L'uso di F4/80 è un indicatore ben accettato per macrofagi murini, ma macrofagi umani non hanno tali indicatori ben definiti e questo può porre problemi nel valutare il tessuto polmonare umano per espressione di MET. L'analisi di espressione di MET nel tessuto polmonare può essere più difficile, ci sono molti altri tipi di cellule e i METs tendono ad essere spinto sul pareti alveolari. Quando si analizzano le sezioni di tessuto, METs sono visualizzati meglio quando sono piatte in sezione trasversale; Se i METs sono in un piano diverso, che può essere difficile stabilire se un MET è presente. Questo problema può essere risolto in una certa misura facendo z-stack per consentire più profondi aerei (3D) del tessuto per l'esame di METs e il potenziale per visualizzare i METs in diversi aspetti.
Non esiste un metodo ben accettato per definire la presenza di METs in campioni del polmone. I metodi descritti sono basati su quelli utilizzati per la visualizzazione di reti. Chow et al. descritto che il mitogene PMA indotto METs in una linea cellulare del macrofago, come valutato dalla presenza di cromatina extracellulare15. Uno studio successivo ha dimostrato che la tubercolosi del micobatterio ha indotto METs in vitro, come definito dalla presenza di cromatina extracellulare e H3Cit16. Abbiamo dimostrato in vivo in un modello di glomerulonefrite, che METs sono presenti nel rene come definito dal co-localizzato della cromatina, istone e mieloperossidasi7. Infine, abbiamo dimostrato la presenza di METs in vitro in macrofago polmonare umano tramite la combinazione di cromatina extracellulare e MMP126. Il nostro metodo può essere utilizzato da altri ricercatori per ricercare questo aspetto importante della risposta infiammatoria.
È probabile che venga riconosciuta METs ad avere un ruolo importante nella malattia infiammatoria cronica. I processi che portano alla NETosis sono ancora non ben definiti. Lo studio dei METs può fornire importanti intuizioni i meccanismi di formazione di trappola. Lo sviluppo di protocolli con altri indicatori e studi funzionali dei METs definirà ulteriormente il ruolo dei METs nella malattia.
Ci sono passaggi critici che abbiamo identificato in questo protocollo. I campioni umani di BAL sono probabili avere contaminazione batterica secondaria e l'uso degli antibiotici in terreno di coltura è importante per limitare la contaminazione. Gli anticorpi primari e secondari possono variare nella loro fluorescenza, anche con il produttore stesso. Infine, l'analisi dei campioni di tessuto polmonare è più complesso di campioni BAL e richiede tempo per sviluppare un approccio standardizzato.

Trappole extracellulari del neutrofilo (reti), furono descritti per la prima volta da Brinkmann et al. 1 essi sono principalmente prodotte in risposta all'infezione (soprattutto ai batteri) e hanno un ruolo importante nella difesa ospite1,2. Sono stati descritti anche per verificarsi in risposta a malattie non infettive, compreso vasculitis ed eritematoso di lupus sistematico (SLE); e al mitogene phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente è stato riconosciuto che altri tipi delle cellule possono anche produrre trappole extracellulari, tra cui i macrofagi. Trappole extracellulari del macrofago (METs) non sono ancora un'entità ben definita in letteratura4,5. Recentemente abbiamo stabilito i metodi per rilevare la presenza di METs sia in vitro che in vivo6,7. In questo articolo, descriveremo la misurazione dei METs usando la microscopia confocal.
Caratteristiche principali di NETosis che lo distinguono dalle altre vie cellulari (ad esempio apoptosi8) sono l'estrusione della cromatina in collaborazione con: (1) citrullination di istoni (H3Cit)9, (2) co-espressione delle proteasi granello10 e (3) coinvolgimento del peptidil arginina deiminasi (PAD) 411,12. I macrofagi esprimono anche H3Cit, proteasi granello e PAD, e queste caratteristiche possono essere utilizzate per definire la presenza dei METs.
METs può avere un ruolo particolarmente importante nel polmone, come il macrofago è la cella dominante presente nelle vie aeree del polmone e gli alveoli e ha il ruolo iniziale nel dirigere la risposta immunitaria cellulare all'infezione/infiammazione. Inoltre, mentre gran parte del polmone è spazio vuoto (per esempio, all'interno di alveoli), i METs sono potenzialmente in grado di espandersi nello spazio disponibile, in contrasto con gli organi solidi.
Il metodo più utilizzato per definire la presenza di reti è mediante microscopia confocale. Non c'è ancora un modo chiaramente definito per misurare METs. La tecnica per la misurazione delle reti è stata adattata per misurare la presenza dei METs in questo protocollo. I requisiti principali per questo metodo sono accesso alla microscopia confocale e appropriato software di imaging per l'analisi.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Human samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 concentration not quantifiable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascites, no concentration given</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mouse samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slides</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotype control</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Sheep IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software Programs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Confocal scanning microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue sources&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natural formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 black 6</td><td>Monash animal research platform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Un metodo primario impiegato per definire la presenza di trappole extracellulari del neutrofilo (reti) è la microscopia confocale. Abbiamo modificato i metodi di microscopia confocale stabilito per visualizzare trappole extracellulari del macrofago (METs). Queste trappole extracellulari sono definite dalla presenza di cromatina extracellulare con co-espressione di altri componenti quali le proteasi del granello, citrullinato istoni e peptidilico arginasi deiminasi (PAD). L'espressione di METs è generalmente misurata dopo l'esposizione ad uno stimolo e confrontato ai campioni non-stimolati. I campioni inoltre sono inclusi per controllo di sfondo e isotype. Le cellule sono analizzate utilizzando software di analisi di immagine ben definita. Microscopia confocale può essere utilizzata per definire la presenza di METs sia in vitro che in vivo nel tessuto polmonare.

METs può essere visualizzato da campioni BAL, nel tessuto polmonare e nelle sezioni più spesse del polmone con immagini 3D. Nella Figura 1è riportato un esempio di METs visualizzati in un campione di BAL. La morfologia dei METs varierà secondo la loro fase di maturazione. La prima caratteristica rilevabile su microscopia è il movimento del nucleo al bordo della cella. Questa è seguita da extracellulare della cromatina con altri mediatori co-espressi, quali le proteasi H3Cit e granuli. Nelle fasi precedenti, la cella ha ancora una forma approssimativamente sferica con la trappola extracellulare espressa. Nelle fasi successive, la formazione di MET è caratterizzata dall'allungamento del corpo della cellula.
Tessuto polmonare METs sono mostrati nella Figura 2. Come i polmoni sono gonfiati con fluido per definire l'architettura del polmone, i METs generalmente saranno spinto contro le pareti alveolari. La morfologia dei METs variano anche a seconda di quale aereo il tessuto è stato tagliato in. Le sezioni standard utilizzate per i campioni di tessuto polmonare sono 4-5 µm di spessore. Sezioni di tessuto più spessore attivare più immagini da adottare e i METs possono poi essere visualizzati in 3D. Gli anticorpi penetrerà solo finora nel tessuto polmonare e uno spessore della sezione di 25-50 µm è ottimo. Un esempio di un'immagine 3D è mostrato in Figura 3 e in 1 dei Video.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
Figura 1: BAL METs. METs BAL umana formata dopo stimolazione nelle diverse fasi dello sviluppo. METs sono stati caratterizzati da extracellulare della cromatina con co-espressione di H3Cit e MMP9. Macchiatura della cromatina (A), (B) H3Cit, MMP9 (C) e (D) l'immagine unita. Inserti del pannello sono controlli di isotipo. Barre di scala = 10 µm (15 µm per isotipo). Una fase precedente MET è mostrata in alto a destra e ha una forma approssimativamente sferica. Un MET più maturo è mostrato in mezzo al campo. Immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo di olio NA 40 x 1.0 di scansione laser. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
Figura 2: tessuto polmonare METs. Murino METs nel tessuto polmonare dopo stimolazione. I METs sono stati caratterizzati da extracellulare della cromatina con co-espressione di H3Cit, MMP9 e F4/80 (come un indicatore del macrofago). Pannello (A) Mostra un tipico campo di visione ad alta potenza utilizzato per misurare il numero dei METs; Pannelli (B–F) mostrano l'area quadrata tratteggiata sotto ingrandimento maggiore. Macchiatura della cromatina (B), (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 e (F) l'immagine unita. Pannello Inserisci è il controllo di isotipo. Scala bar = 20 micron (20 micron per isotipo). METs vengono generalmente spinti contro le pareti alveolari. Immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo di 40 x 1.3 NA olio di scansione laser. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
Figura 3: vista tridimensionale della sezione polmonare. Tessuto polmonare del mouse è stato risolto e tagliato in sezioni spesse di 25-35 µm. Tessuto è stato etichettato con marcatori per METs ed imaged con sezioni a 1 µm di spessore. Immagini sono state combinate con un z-stack per creare un'immagine 3-dimensionale di un MET. Immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo di 40 x 1.3 NA olio di scansione laser. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
Video 1: visione tridimensionale della sezione polmonare. Video corrisponde ai campioni presentati in Figura 3. Le zecche asse = 5 µm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Monash Medical Centre. Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.

Video: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Medicina

Colorazione e imaging per visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autore in primo piano: Imaging di trappole extracellulari neutrofile in tessuti umani e di topo 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

Source: Zhang, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60541">In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vitro stimulation of macrophage extracellular traps (METs) in human monocyte-derive macrophages using different inflammatory stimuli such as TNF-alpha, PMA, and HOCL. The video also demonstrates the method of SYTOX dye staining of METs for visualization.

Stimolazione e visualizzazione in vitro di trappole extracellulari per macrofagi

1. Polarization of HMDM

	Under sterile conditions, prepare the M1 priming media by adding interferon &#947; (IFN&#947;; 20 ng/mL) and lipopolysaccharide ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

Source: Sharma, R. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56459">Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the immunolabeling of macrophage extracellular traps, METs, in bronchoalveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid, and their visualization using a confocal microscope.

Visualizzazione di trappole extracellulari in macrofagi da fluidi di lavaggio broncoalveolare umano

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) ...

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

L'uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Stimolazione e visualizzazione in vitro di trappole extracellulari per macrofagi

Visualizzazione di trappole extracellulari in macrofagi da fluidi di lavaggio broncoalveolare umano