Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Monash, la salud nacional y Consejo de investigación médica y el pulmón de Monash e Instituto del sueño. Los autores desean dar las gracias al personal de inmunología clínica en salud de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass y Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) ayuda con la microscopía confocal de imágenes, y los autores reconocen las instalaciones MMI de la Universidad de Monash. Los autores reconocen las instalaciones y asistencia científica y técnica de la plataforma de la histología de Monash.

este protocolo sigue experimentos aprobados en: (1) los seres humanos por el Comité de ética de Monash Medical Centre y (2) animales por el Comité de ética de la Universidad de Melbourne.
 1. macrófagos de lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li>BAL de uso para obtener los macrófagos del pulmón en: (1) humanos sujetos por broncoscopia 6 y (2) ratones utilizando aspiración intra traqueal 13 . 
	Nota: La adquisición de los macrófagos generalmente hace algunos activación de estas células. Los macrófagos se obtienen de pacientes que requieren una broncoscopia para investigar un problema médico y no todos los temas pueden ser adecuados para el análisis de METs (esto deberá ser determinado para cada proyecto individual).
	<ol><li>Tomar la solución BAL y el giro de (500 x g por 10 min) para formar una pelotilla, lavar dos veces con medio de cultivo (Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) con suero de ternera fetal de 5% y 1% L-glutamina) a temperatura ambiente y luego diluir las células en 4 mL de cultura medi Um.</li>
		<li>Si es necesario, mediante solicitud formal cuenta diferencial; la mayoría de las células (generalmente &#62; 80%) serán los macrófagos 6. 
		Nota: Esto será generalmente interpretado por un servicio de histología clínica utilizando la apariencia morfológica de las células diferentes tipos 6.</li>
		<li>Realizar una célula macrófago viable contar con la solución BAL mediante exclusión del azul tripán y un hemocitómetro. 
		Nota: Solución BAL se obtiene de los seres humanos y ratones como se menciona en el paso 1.1.</li>
		<li>Agregar de 1-4 x 10 5 macrófagos para placas de 24 pocillos en cubreobjetos en 500 μl de medio de cultivo por pozo y dejar toda la noche a 37 ° C, las células se adhieran al cubreobjetos. Para muestras humanas, añadir antibióticos (p. ej., penicilina y estreptomicina, 10 4 U/mL) para prevenir la contaminación bacteriana.</li>
	</ol></li></ol> 2. Etiquetado/microscopia de la inmunofluorescencia de los macrófagos de BAL Nota: las células se adhieren sobre cubreobjetos según lo mencionado arriba.
<ol><li>Lave las células una vez con tampón fosfato salino (PBS) y el medio de cultivo. Fijar las células en fijador de paraformaldehido periodato/lisina (PLP) de 2% durante 10 minutos</li>
	<li>Lavar las células brevemente en PBS y luego permeabilizar en 0.2% Tween 20 en PBS durante 20 min</li>
	<li> Células de bloque con sueros de pollo 10% en 5% albúmina de suero bovino (BSA) diluido en PBS durante 30 minutos</li>
	<li>Incubar con control primario y el isotipo de anticuerpos por 1 h a temperatura ambiente en concentraciones de 1: 100 (detalles más específicos se enumeran en la Tabla de materiales) a 37 ° C. 
	Nota: Las muestras de BAL, un marcador específico de macrófagos generalmente no es necesario.</li>
	<li>Después de la adición de anticuerpos primarios, lave las células en PBS e incubar más con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las secciones en PBS y Monte con medio de montaje basado en DAPI de visualización mediante un microscopio confocal (como se mencionó anteriormente) en laser excitaciones 405, 488, 561 y 647 nm y 40 X, 1,0 NA aceite objetivo.</li>
</ol> 3. Muestras de tejido pulmonar Nota: para los estudios en vivo del tejido pulmonar, estudio de las muestras después de la exposición relevante (por ejemplo, según lo descrito por O &#39; Sullivan et al. 7). la exposición que es más relevante para este experimento son microorganismos infecciosos, especialmente bacterias. Cepas de ratón que podrían ser utilizadas para este método son hombre, ratones C57BL/6 y BALB/c, 10-12 semanas de edad y peso 25-30 g.
<ol><li>Euthanize ratones, a través de una inyección intraperitoneal de ketamina (400 mg/kg) y xilacina (40 mg/kg). Abrir la cavidad torácica y exponer los pulmones y el corazón usando tijeras y pinzas quirúrgicas.
	<ol><li>Infundir PBS caliente usando una aguja de calibre 21 en el ventrículo derecho para lavar la sangre de los vasos por 30 s, luego infundir 10 mL de fijador PLP 2% durante 30 s (en el ventrículo derecho).</li>
		<li>Usar caliente PBS (42 ° C) para lavado de la cavidad torácica abierta. Intubar la tráquea con una aguja de calibre 21 y un pedazo de 0,8 mm tubo cortado a la medida e inyectar 800 μl de precalentado (hasta 42 ° C), bajo punto de fusión punto de solución de agarosa al 3%.</li>
		<li>Lazo frente a la tráquea con seda trenzada (4.0 USP). Coloque el hilo alrededor de la tráquea, justo debajo del punto de inserción de la cánula y garantizar por medio de un nudo simple. Para que solidifique la agarosa, administrar PBS helado alrededor de los pulmones. Retire los pulmones y el corazón como a una cuadra de la cavidad torácica, usando tijeras y disección Roma. Quite individualmente cada pulmón y luego fijarlos por 16 h en 2% PLP o formalina al 4 ° C.</li>
		<li>Almacenar a los especímenes en PBS a 4 ° C hasta el tejido seccionado. Estos métodos de obtención de tejido pulmonar han sido previamente descritos 13.</li>
	</ol></li> <li>Para preparar el tejido pulmonar las muestras utilizan los pasos siguientes.
	<ol><li>Fix pulmón tejidos (resecados en el paso 3.1) del tejido en formalina 10% de tampón natural durante 24 h a temperatura ambiente. Transferencia de 75% de etanol y coloque en un procesador de tejidos en un ciclo de 12 h, (2.5 h en 75% EtOH, 3 h en EtOH absoluto, 3,5 h en solvente 3B y 3 h en parafina).</li>
		<li>Embed en parafina estándar para crear formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) los bloques que se almacenan a temperatura ambiente. 
		Nota: En esta etapa, es generalmente conveniente cortar las secciones del pulmón para portaobjetos estándar.</li>
		<li>Cortar las secciones del pulmón FFPE en 4-5 μm de espesor utilizando un micrótomo y Monte en carga, portaobjetos recubiertos como se describió anteriormente o &#39; Sullivan et al. 7</li> <li>montar diapositivas, poner 3 gotas de medio de montaje de 60 mm x 24 mm cubreobjetos (tamaño 1.5), invertir la diapositiva sobre el cubreobjetos y empuje hacia fuera exceso medio. Herméticamente sellado con esmalte de uñas y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparación/microscopia de muestras de tejido pulmonar <ol><li>a la cera, rehidratar y prepare la muestra de tejido de pulmón FFPE con solución de recuperación de antígeno.
	<ol><li>Horno seco el FFPE desliza durante 60 min a 60 ° C. Luego que los portaobjetos en solución de xileno durante 30 min y la transferencia de solución de etanol 70% por 5 min a temperatura ambiente. Enjuague en agua del grifo.</li>
		<li>Lugar en envoltura plástica resistente al calor y recuperación de HIER-antígeno en una olla a presión durante 10 minutos en 10 m/mol/L Tris, pH 9.0 de 1 mmol/EDTA. Fresco durante 20 min lavado dos veces en agua corriente durante 5 minutos en un rockero, luego una vez con PBS en rocker.</li>
		<li>Bloque con suero de pollo 10% 5% BSA/PBS por 30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Manchar el tejido.
	<ol><li>Definir METs en macrófagos, añadir anticuerpos primarios (MMP-9, H3Cit y F4/80) en el 1% BSA/PBS durante 16 horas a 4 ° C en la dilución 1/100 (detalles específicos sobre cantidades de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales). Lave dos veces con PBS durante 5 minutos en un eje de balancín de.</li>
		Anticuerpos <li>lograr detección fluorescente por la incubación con secundario correspondiente en 1% BSA/PBS durante 40 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos son: anti-ratón (1) pollo 488 (verde), (2) pollo contra cabra 594 (rojo) y anti-ratón (3) el burro (ahora rojos) 647.</li>
		<li>Lavar las secciones en PBS y Monte con DAPI que contiene el medio de montaje para la tinción de la cromatina.</li>
	</ol></li> <li>Obtener imágenes fluorescentes usando un láser confocal de barrido cabeza conectada a un microscopio invertido.
	Láseres de <ol><li>Excite la preparación con 405, 488, 561 y 647 nm. Capturar imágenes de 512 x 512 píxeles de plano solo haciendo clic en la línea secuencial, nivelación de botón (2 promedio de la línea) usando 20 X 0.1 aceite aire NA y NA 40 X 1.0 objetivos.</li>
		<li>Obtener por lo menos diez campos de vista por la sección de análisis de datos y para cada resultado (es decir, alta potencia 10 campos de vista (HFOV) para el control, 10 para la muestra estimulada, etc., para cada ratón). 
		Nota: Para obtener una muestra representativa de todo el campo, un sistema de matriz puede utilizarse en los que se divide el campo en diferentes secciones y para cada muestra diferente de la misma matriz se utiliza para seleccionar campos de vista (por ejemplo, el campo se puede dividir en 9 secciones, y desde el centro y las 4 esquinas, se toman dos VOAF).</li>
	</ol></li></ol> 5. Tridimensional (3D) imagen de METs Nota: METs son estructuras 3-d, tomando z-stack múltiples imágenes, que se reconstituyen, pueden dar valiosa información.
<ol><li>Sección las muestras de pulmón de bloques de parafina, a 200 μm con un vibratome a una amplitud de 1,8 mm y velocidad de 0.1-0.5 mm/s.</li>
	<li>Bloque de tejido pulmonar con 20% de suero correspondiente (10% de suero de ternero fetal y suero de pollo 10%) y luego permeabilizar en PBS suplido y 3,75% Triton-X 100 de 7 h a temperatura ambiente en agitación suave.</li>
	<li>Mancha las secciones de 16 h a 4 ° C con los anticuerpos primarios pertinentes (MMP-9, H3Cit y F4/80) en volúmenes de 200 μL en tubos de microcentrífuga (concentraciones de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales).</li>
	<li>Lávese las secciones en PBS 3 veces durante 10 minutos antes de la incubación con los anticuerpos secundarios relevantes a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Mancha las secciones del pulmón para DAPI (1:5, 000) en la solución por 20 min, antes de agregar el cubreobjetos al microscopio portaobjetos en PBS.</li>
	<li>Obtención de imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal invertido (40 x 1,3 NA) equipado con 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm y láseres de 635 nm.</li>
	<li>Grabar 3D z-pilas de 0.54 μm de grosor con el seccionamiento de z óptimo para el objetivo de 40 x 1,3 NA aceite. 
	Nota: El software utilizado variará dependiendo del microscopio individual. Un ejemplo de cómo el software se puede utilizar para un microscopio se proporciona en archivo adicional 1.</li>
</ol> 6. Análisis de imagen Nota: el análisis de las muestras requiere el uso de software de análisis de imágenes específicas y los ejemplos se enumeran en la Tabla de materiales. Mientras que el análisis de los resultados dependerá del programa específico utilizado, los puntos enumerados a continuación son importantes.
<ol><li>Las muestras de análisis de BAL <ol><li>definir el número de macrófagos, seleccione el canal azul para DAPI y asignar un tamaño mínimo para las células (p. ej., &#62; 18 μm de diámetro). El software relevantes, medir el número de macrófagos por campo.</li>
		<li>Cuenta el número de células que tienen las características de un MET por la presencia de cromatina extracelular detectada por DAPI con coexpresión de marcadores (por ejemplo, MMP12, PAD2 y H3Cit). 
		Nota: El número de marcadores que pueden ser analizadas depende del número de láseres disponibles, pero idealmente además de DAPI, por lo menos dos otros marcadores deben ser incluidos. Otras menos parámetros específicos para la expresión de MET (p. ej., número de células con un núcleo agrandado y cromatina extracelular) se puede utilizar.</li>
		<li>Para comparar la expresión MET BAL muestras (entre el control, humo y humo/DNasa tratado grupos), analizan un mínimo de 100 macrófagos BAL por ejemplo.</li>
		<li>Para medir el anticuerpo secundario e isotipo controlar los niveles de fluorescencia; medir un mínimo de 100 células en cada muestra de su fluorescencia. Medir el nivel medio de la fluorescencia de fondo para cada marcador (por ejemplo, H3Cit) utilizando el software estándar de.</li>
		<li>Para definir expresión MET, contar las células con el fenotipo típico (e.g., cromatina extracelular con coexpresión de H3Cit y MMP9) y para cada MET, medir el nivel de fluorescencia de marcadores (por ejemplo, H3Cit y MMP9). Excluir las células produciendo METs si su coloración no era sobre el control de fondo e isotipo.</li>
		<li>Para muestras humanas de BAL, analizar un mínimo de 100 células por cada muestra el porcentaje de macrófagos que hacen METs. Para las muestras de murinas, como las células son más pequeñas y METs son más difíciles de definir, analizar un mayor número de células por cada muestra (p. ej., 200 macrófagos).</li>
	</ol></li> <li>Análisis de muestras de tejido pulmonar <ol><li>para determinar la presencia de METs en tejido pulmonar, utilice el marcador de macrófagos específicos como F4/80.</li>
		<li>Definir la presencia de METs en tejido pulmonar por medio de la co-localización de F4/80 en las células que expresan la cromatina extracelular con otros parámetros que se enumeran en la sección 6.1.</li>
		<li>Determinar los niveles de fluorescencia en muestras con anticuerpo secundario del fondo y los controles de isotipo. Excluir METs del análisis que sobre el fondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. 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Los autores no tienen ninguna revelaciones a realizar en relación con este trabajo.

El método descrito en este informe se basa en que para la determinación de la presencia de redes14. Los macrófagos son el tipo celular dominante en muestras de BAL y este método de colección es especialmente adecuado para el estudio de METs. Si glóbulos rojos están presentes en el BAL, estas células deben lisis mediante el uso de cloruro de amonio. El procedimiento de BAL generalmente activa los macrófagos y por lo tanto se espera que habrá METs presentes en las muestras no estimuladas. Los macrófagos de BAL son generalmente muy adherentes. Los macrófagos BAL generalmente no necesita un marcador específico como estas células son el tipo celular dominante y también se pueden diferenciar por su morfología. Generalmente en un BAL, mayor que 80% de las células son los macrófagos y neutrófilos son menos de 5% y después de múltiples lavados, generalmente sólo los leucocitos adherentes (es decir, los macrófagos) siguen siendo6. Si hay duda sobre la capacidad de distinguir entre los macrófagos neutrófilos en los seres humanos, puede utilizarse un marcador como elastasa de neutrófilo. En tejido pulmonar, un marcador de macrófagos específicos (por ejemplo, F4/80) se requiere que los macrófagos son difíciles de distinguir de otros tipos de células. Los macrófagos tienen auto fluorescencia por el uso de controles de antecedentes y el isotipo es importante; Este es particularmente el caso con las muestras estimuladas.
La mejor manera de definir la presencia de METs queda por determinarse. Caminos y procesos específicos, que son comunes a los neutrófilos y los macrófagos son: proteasas (1) granulares, (2) citrullination de las histonas y (3) cojín. 4 es más específico para neutrófilos, mientras que PAD2 es más prominente en los monocitos/macrófagos. El uso de F4/80 es un marcador bien aceptado por los macrófagos murinos, pero los macrófagos humanos no tienen tales marcadores bien definidos y esto puede plantear problemas al evaluar el tejido de pulmón humano expresión MET. Análisis de expresión de la MET en tejido pulmonar pueden ser más difícil ya que hay muchos otros tipos de células y los METs tienden a ser empujado sobre las paredes alveolares. Al analizar las secciones de tejido, METs se visualizan mejor cuando están en sección transversal; Si los METs están en un plano diferente puede ser difícil determinar si un MET está presente. Este problema puede abordarse en cierta medida haciendo z-pilas para permitir más planos (3D) de tejido para examinar los METs y la posibilidad de visualizar los METs en diferentes aspectos.
No es un método bien-aceptado para definir la presencia de METs en muestras de pulmón. Los métodos descritos se basan en los utilizados para la visualización de redes. Chow et al. describió que el mitógeno PMA indujo METs en una línea celular de macrófagos, según lo determinado por la presencia de cromatina extracelular15. En un estudio posterior demostró que Mycobacterium tuberculosis induce METs in vitro, tal como se define por la presencia de cromatina extracelular y H3Cit16. Hemos demostrado en vivo en un modelo de glomerulonefritis, que los METs están presentes en el riñón según lo definido por cromatina, histonas y mieloperoxidasa Co localizado7. Por último, hemos demostrado la presencia de METs en vitro en macrófagos de pulmón humano por la combinación de cromatina extracelular y MMP126. Nuestro método puede usarse por otros investigadores para investigar esta importante faceta de la respuesta inflamatoria.
Es probable que el METs reconocerá a tener un papel importante en la enfermedad inflamatoria crónica. Los procesos que conducen a la NETosis son todavía no bien definidos. El estudio de los METs puede proporcionar penetraciones importantes en los mecanismos de formación de la trampa. El desarrollo de protocolos con marcadores más y estudios funcionales de METs se definirán el papel de los METs en la enfermedad.
Hay pasos críticos que hemos identificado en el presente Protocolo. Las muestras de BAL humanas son propensas a contaminación bacteriana secundaria y el uso de antibióticos en medio de cultivo es importante para limitar la contaminación. Los anticuerpos primarios y secundarios pueden variar en su fluorescencia, incluso con el mismo fabricante. Finalmente, el análisis de las muestras de tejido pulmonar es más complejo que las muestras de BAL y requiere tiempo para desarrollar un enfoque estandarizado.

Neutrófilos trampas extracelulares (redes), primero fueron descritos por Brinkmann et al. 1 que predominantemente se producen en respuesta a la infección (especialmente a las bacterias) y tienen un papel importante en host defense1,2. También se han descrito para ocurrir en respuesta a enfermedades no infecciosas, incluyendo vasculitis y lupus eritematoso sistémico (les); y a los mitógenos forbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Se ha reconocido recientemente que otros tipos celulares pueden también producir trampas extracelulares, incluyendo los macrófagos. Trampas extracelulares del macrófago (MET) todavía no son una entidad bien definida en la literatura4,5. Recientemente hemos establecido los métodos para detectar la presencia de METs tanto in vitro e in vivo6,7. En este artículo, se describen la medida de METs usando microscopia confocal.
Características clave de NETosis que la distinguen de otras vías celulares (tales como apoptosis8) son la extrusión de la cromatina en relación con: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) la expresión de proteasas de gránulo10 y (3) participación de peptidil arginina deiminase (PAD) 411,12. Macrófagos también expresan H3Cit, proteasas de gránulo y almohadilla, y estas características pueden utilizarse para definir la presencia de METs.
METs de pueden tener un papel particularmente importante en el pulmón, como el macrófago es la célula dominante presente en los alvéolos y las vías respiratorias del pulmón y tiene la función inicial en la dirección del cellular la respuesta inmune a la infección/inflamación. Además, mientras que gran parte del pulmón es espacio vacío (por ejemplo, dentro de los alvéolos), los METs son potencialmente capaces de expandirse en el espacio disponible, a diferencia de órganos sólidos.
El método más utilizado para definir la presencia de redes es mediante microscopía confocal. Aún no existe una forma claramente definida para medir METs. La técnica para la medición de redes ha sido adaptada para medir la presencia de METs en el presente Protocolo. Los principales requisitos para este método son el acceso a la microscopia confocal y el software apropiado de imágenes para análisis.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Human samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 concentration not quantifiable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascites, no concentration given</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mouse samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slides</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotype control</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Sheep IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software Programs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Confocal scanning microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue sources&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natural formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 black 6</td><td>Monash animal research platform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Un método primario utilizado para definir la presencia de neutrófilos trampas extracelulares (redes) es la microscopia confocal. Hemos modificado microscopía confocal establecido métodos para visualizar las trampas extracelulares del macrófago (MET). Estas trampas extracelulares se definen por la presencia de cromatina extracelular con coexpresión de otros componentes como gránulo proteasas, las histonas citrulinado y peptidil arginasa deiminase (PAD). La expresión de METs es generalmente medida después de la exposición a un estímulo y en comparación con muestras no estimuladas. Las muestras también se incluyen para el control del fondo y el isotipo. Las células son analizadas utilizando el software de análisis de imagen bien definida. La microscopia confocal puede utilizarse para definir la presencia de METs en vitro y en vivo en el tejido pulmonar.

METs se pueden visualizar de muestras de BAL, en tejido pulmonar y en secciones gruesas de pulmón con imágenes 3D. En la figura 1se muestra un ejemplo de METs visualizado en una muestra de BAL. La morfología de los METs variarán según su etapa de maduración. La primera característica detectable en microscopia es el movimiento del núcleo al borde de la celda. Esto es seguido por cromatina extracelular con otros mediadores Co expresados, como proteasas H3Cit y del gránulo. En las primeras etapas, la célula todavía tiene una forma aproximadamente esférica con la trampa extracelular expresada. En etapas posteriores, la formación de MET se caracteriza por alargamiento del cuerpo de la célula.
Tejido pulmonar METs se muestran en la figura 2. Como se inflan los pulmones con líquido para definir la arquitectura del pulmón, los METs generalmente se empujó contra las paredes alveolares. La morfología de los METs también variará dependiendo de que se redujo a plano el tejido. Las secciones estándar utilizadas para las muestras de tejido pulmonar son 4-5 μm de espesor. Secciones gruesas de tejido permiten múltiples imágenes a ser tomadas y los METs entonces pueden verse en 3-d. Los anticuerpos sólo penetrará hasta ahora en el tejido pulmonar y de 25-50 μm de espesor sección es óptimo. Un ejemplo de una imagen 3D se muestra en la figura 3 y en el Video 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
Figura 1: BAL METs. METs de BAL humano formado después de la estimulación en las diferentes etapas de desarrollo. METs se caracterizaron por cromatina extracelular con coexpresión de H3Cit y MMP9. Tinción de la cromatina (A), (B) H3Cit, MMP9 (C) y (D) la imagen fusionada. Insertos de panel son controles de isotipo. Barras de la escala = 10 μm (μm 15 de isotipo). Una etapa anterior MET se muestra en la esquina superior derecha y tiene una forma aproximadamente esférica. Un MET más maduro aparece en medio del campo. Imágenes fueron tomadas usando un láser de barrido microscopio confocal y un objetivo de 40 x 1.0 NA aceite. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
Figura 2: tejido pulmonar METs. Murinos METs en tejido pulmonar después de la estimulación. Los METs se han caracterizado por cromatina extracelular con coexpresión de H3Cit, MMP9 y F4/80 (como un marcador de macrófagos). Panel (A) muestra un típico alta potencia campo visual utilizado para medir el número de METs; Paneles (B–F) muestran el área cuadrada discontinuo con mayor aumento. Tinción de la cromatina (B), (C) H3Cit, (D) MMP9, F4/80 (E) y (F) la imagen fusionada. Panel Insertar es el control de isotipo. Barras de escala = 20 μm (20 μm para el isotipo). METs se generalmente empuja contra las paredes alveolares. Imágenes fueron tomadas usando un láser de barrido microscopio confocal y un objetivo de 40 x 1,3 NA aceite. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
Figura 3: vista tridimensional de la sección del pulmón. Tejido de pulmón de ratón era fija y corte en secciones gruesas de 25-35 μm. Tejido fue etiquetado con marcadores para METs y reflejada con las secciones de 1 μm de grosor. Imágenes se combinaron con una pila de z para crear una imagen en 3 dimensiones de un MET. Imágenes fueron tomadas usando un láser de barrido microscopio confocal y un objetivo de 40 x 1,3 NA aceite. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
Video 1: vista tridimensional de la sección del pulmón. Video corresponde a las muestras presentadas en la figura 3. Las garrapatas de eje = 5 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>

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Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K vistas.  Monash Medical Centre. Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.

Video: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Medicina

Tinción e imágenes para visualizar trampas extracelulares de neutrófilos

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autor destacado: Imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

Source: Zhang, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60541">In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vitro stimulation of macrophage extracellular traps (METs) in human monocyte-derive macrophages using different inflammatory stimuli such as TNF-alpha, PMA, and HOCL. The video also demonstrates the method of SYTOX dye staining of METs for visualization.

Estimulación in vitro y visualización de trampas extracelulares de macrófagos

1. Polarization of HMDM

	Under sterile conditions, prepare the M1 priming media by adding interferon &#947; (IFN&#947;; 20 ng/mL) and lipopolysaccharide ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

Source: Sharma, R. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56459">Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the immunolabeling of macrophage extracellular traps, METs, in bronchoalveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid, and their visualization using a confocal microscope.

Visualización de Trampas Extracelulares en Macrófagos a partir de Fluidos de Lavado Broncoalveolar Humanos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
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Resumen

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