Name: synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System at JoVE.com

Questo materiale si basa su lavori sostenuta dall'Office of Naval Research award numero N00014-13-1-0074 (V.N.), Human Frontier Science Program grant numero RGP0037/2015 (per V.N.) e la Fondazione di scienza binazionale concedere 2014400 (al V.N.).

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metab Eng. , (2011).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/mL+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+cell-free+expression+toolbox:+application+to+synthetic+gene+circuits+and+artificial+cells.">An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells.</a> ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expanded+cell-free+protein+synthesis+using+endogenous+pyrrolysyl+orthogonal+translation+system.">Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system.</a> Biotechnol Bioeng. , (2015).</li><li>Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis.">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+Rapid+Prototyping+of+Synthetic+Biological+Circuits+in+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+System.">Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System.</a> Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. , (2015).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth Biol. , (2016).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies:+tubes,+rings,+and+doughnuts.">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins.">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems.">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes.">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly.">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li><li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding:+biochemical,+biophysical,+and+physiological+consequences.">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li></ol>

Gli autori dichiarano l'interesse finanziario concorrenti seguenti: Noireaux laboratorio riceve fondi per la ricerca da microarray, un distributore del kit di espressione della proteina senza cellula MYtxtl.

Seguendo la tecnica in Chen, et al. 14 per SPMC, un passaggio critico è raggiunto nel determinare le condizioni adeguate per superinfezione. Il parametro che controlla maggiormente capacità di un ceppo di host di resistere a superinfezione è frequentemente la concentrazione iniziale del fago d'infezione. Cellule dell'ospite devono essere in fase di crescita logaritmica prima infezione iniziale con una piccola quantità del fago. Alla fine, il fago raggiungerà anche crescita logaritmica e l'obiettivo è quello di consentire i numeri dei fagi a superare rapidamente il conteggio delle cellule, permettendo per le copie multiple del fago in ogni cellula ospite. In questo modo la cellula in uno stato di quasi-stabile dove non subirà lisi. Se questo stato non viene raggiunto, le cellule subiscono lisi CSS, confluenti e rilasciare il loro carico virale. Se superinfezione può essere raggiunto utilizzando le concentrazioni di virale iniziale sopra, è possibile abbassare la molteplicità iniziale dell'infezione di un fattore dieci prima di fare un tentativo successivo. Se lisare cellule dell'ospite prima del raccolto e superinfezione non viene raggiunto, procedere immediatamente con una procedura di purificazione separato. Aggiungere dnasi I a 5 µ g/mL e 500 µ l CHCl3 per finalizzare tutto cellulare lisi. Continuare a ricciolo per altri 5 minuti e poi Centrifugare a 10.000 x g per rimuovere i detriti cellulari. Decantare e centrifugare il supernatante a 75.000 x g per 1-2 h di pellet il fago e risospendere durante la notte in 1 mL di tampone per TM totale 1x a 4 ° C senza agitazione. Durante il test di superinfezione utilizzando un piccolo volume delle cellule, è possibile misurare quanto vicino cellule sono alla lisi da quanto velocemente si lyse quando esposti al cloroformio aggiunto. Se lisare le cellule e la soluzione chiarisce quasi istantaneamente, le pareti cellulari sono molto instabili e le cellule devono essere raccolte immediatamente per impedire Lisi cascata su larga scala. Se il test di lisi entro 1-3 min, i volumi più grandi possono continuare ad superinfect per fino a 2 h, a seconda del locale ceppo di e. coli in uso. Se le cellule non lisare entro 5 min, crescita dei fagi non ha raggiunto per la crescita di Escherichia coli e incubazione primaria dovrebbe continuare. Eseguire nuovamente il test in 30-60 min.
Quando la purificazione dei fagi su un gradiente di saccarosio preparati, il fago apparirà come una band molto spessa, perlescente tra un terzo e due terzi di strada lungo il tubo. Supponendo che un relativamente riuscita lisi e la fase di purificazione cellulare residuo, ci possono essere altri, luce bande ma nessuno di densità o di dimensioni simili. La band grande, opaca contiene il fago e deve essere rimosso dalla soluzione con una siringa sterile e cannula smussa.
Quando si avvia la terza sezione del protocollo, la reazione senza cellula e titolo dei fagi, è meglio usare piastre di coltura fresca (meno di una settimana di età) per la piastra di batteri ospite (dal punto 3.5) e anche le piastre di coltura utilizzate per l'analisi del titolo (dal passaggio 3,21). Ciò promuoverà una maggiore crescita di cellule di batteri ospite e maggiore efficienza di infezione per il titolo dei fagi. Piastre di coltura dei fagi devono essere pre-incubate a 37 ° C per un minimo di 1 h prima di iniziare la parte di titolo dei fagi del protocollo. Senza pre-incubazione delle piastre di coltura dei fagi, la soluzione top-agar (contenente la coltura delle cellule dei fagi e host sintetizzata) non potrà distribuire in modo omogeneo su tutta la superficie della piastra di coltura. Invece, la soluzione top-agar si solidificherà in modo omogeneo sulla superficie (Figura 2b). Questo aumenta la probabilità di fagi multiple localizzazione nello stesso punto, che può causare una sottostima del fago resa nella reazione senza cellula.
Ogni placca rappresenta l'evento di un fago sintetizzato infettare una cellula ospite, replicando all'interno della cellula ospite e la lisi della cellula ospite. Placche crescono in dimensioni durante il periodo di incubazione da progenie dei fagi che infettano vicino cellule dell'ospite dall'evento infezione iniziale. Se non le piastre sono osservate, è possibile che il fattore di diluizione effettuato nel protocollo sezione 4.6 è troppo elevato, con conseguente scarsa probabilità che qualsiasi fago sintetizzato infetta una cellula ospite. Per risolvere questo problema, ridurre il fattore di diluizione di 3-4 ordini di grandezza (o necessario) e ripetere l'esperimento di titolo. Al contrario, il fattore di diluizione potrebbe essere troppo in alto dando in placche che coprono tutta la superficie della piastra di coltura, rendendo impossibile contare il rendimento dei fagi. In questo caso, aumentare il fattore di diluizione di 3-4 ordini di grandezza (o necessario). Per un fago ben caratterizzato, conosciuta la resa della reazione senza cellula e fattore di diluizione solo una per ogni punto di reazione sarà necessario per l'esperimento di titolo. Quando che caratterizzano un nuovo Fago, è preferibile includere fattori di diluizione diversa di 2-3 per ogni punto di reazione, assicurando che uno delle diluizioni produrrà una targa numerabile (vedere la Figura 3 per le differenze tra un numero numerabile e non numerabili di placche su un piatto).
Se nessuna placca è osservata dopo aver modificato il fattore di diluizione del titolo dei fagi, questo potrebbe indicare che la reazione senza cellula era infruttuosa in quanto espressione genica non ha accaduto. Una spiegazione possibile per questo potrebbe essere danni strutturali di reagenti/dei fagi del DNA dovuto l'omogeneizzazione della reazione senza cellula nel Vortex. Per ovviare a questo problema, ripetere la reazione e omogeneizzare toccando delicatamente il tubo di reazione cinque a sette volte con un dito, o mescolando lentamente la reazione con una pipetta di cinque a sette volte.
Il sistema di reazione senza cellula proviene da e. coli e contiene in modo endogeno della polimerasi di RNA di e. coli e il fattore primario di sigma, sigma 70, che si combinano per formare holoenzyme necessario riconoscere il consenso di principale promotore sequenze di geni di Escherichia coli . Inoltre, il sistema di reazione senza cellula può ricapitolare il regime di trascrizione intero fattore sigma fornendo esogenicamente sei altri geni del fattore sigma di e. coli sotto la sequenza di consenso del promotore di sigma 70. In questo modo la capacità di sintetizzare tutti i batteriofagi cui genomi sono compatibili con macchine di trascrizione e traduzione di e. coli. Questo lascia fuori un sottoinsieme del batteriofago che non può essere studiato o sintetizzato con il sistema di reazione senza cellula utilizzato qui.
La piattaforma senza cellula trascrizione/traduzione consente un livello impressionante di controllo e flessibilità delle condizioni di reazione rispetto ai metodi in vivo dello studio. Possiamo accordare finemente molti componenti biochimici e genetici di una reazione dei fagi e osservare direttamente gli effetti in meno di 24h, come mostrato nella Figura 4 per affollamento molecolare. Gli effetti di Crowder molecolare, come PEG, via l'auto-assemblaggio di complessi macromolecolari sono stati teoricamente spiegato e dimostrato in vitro18,19,20. Affollamento molecolare è un'entropia guidato meccanismo che aumenta la costante di associazione di strutture grandi biomolecolari. L'approccio senza cellula consente al ricercatore di sonda complicati processi biologici come la biofisica di auto-assemblaggio con sistemi di modello, come batteriofagi, senza le limitazioni intrinseche del lavoro in vivo .
Questa piattaforma consente inoltre per l'indagine dell'utilità dei fagi in campi applicati. Componenti dei genomi dei fagi possono essere reimpiegati e rapidamente testati in un sistema senza cellula reazione con l'obiettivo di integrare i risultati di nanostrutture romanzo. I batteriofagi possono essere modificati al fine di aumentare la selettività dell'infezione della cellula ospite, che promuoverebbe l'utilità della terapia dei fagi come alternativa per i batteri resistenti agli antibiotici.

Nell'ultimo decennio, la tecnologia di espressione senza cellula è stata studiata per applicazioni innovative di indirizzo in biologia relativa sintetica e quantitativa di aree di ricerca multidisciplinare emergente. Originariamente utilizzato per esprimere proteine indipendenti di un organismo vivente, nuovi sistemi senza cellula di TXTL sono stati sviluppati per entrambi Scienze di base e applicata1,2, ampliando notevolmente il campo di questa tecnologia. La nuova generazione di piattaforme TXTL è stata progettata per essere facile da usare, più efficiente (raggiungendo 2 mg/mL di sintesi proteica in batch mode3), più versatile a livello di trascrizione4e modulare in modo da integrare facilmente romanzo naturale o funzioni sintetiche che ampliano le funzionalità esistenti sistemi biologici5,6. In particolare, sistemi TXTL senza cellula sono diventati comodo per la prototipazione rapida di programmi genetici, quali elementi regolatori o piccoli circuiti genetici7,8,9, riducendo la progettazione-costruzione-prova ciclo per un paio di giorni. Notevolmente, i nuovi sistemi TXTL sono anche in grado di elaborare programmi di grandi dimensioni del DNA come la sintesi completa di fagi10,11, dimostrando forte abbastanza prestazioni per supportare la ricostituzione dell'attivo genomica DNA codificato entità viventi.
TXTL sistemi presentano molti vantaggi rispetto ai tradizionali in vitro costruttiva analisi biochimiche. Senza cellula TXTL collega il processo di espressione genica al prodotto finale in un ambiente aperto e ridotto, in contrasto con il complesso citoplasma di una cellula vivente. TXTL utilizza il DNA per ricostruire sistemi biochimici in vitro, che, con moderne tecniche di assemblaggio di DNA, è conveniente e veloce oltre a non richiedere fasi di purificazione della proteina fastidiosa. Espressione senza cellula fornisce accesso diretto alla maggior parte dei componenti nelle reazioni biochimiche, permettendo così una dissezione più profonda delle interazioni molecolari12. In una reazione di TXTL, uno può cambiare le impostazioni biochimiche e biofisiche a volontà, che è quasi impossibile in una cellula vivente. Dato questi vantaggi e miglioramenti recenti, la tecnologia TXTL sta diventando sempre più popolare come una piattaforma alternativa per la biologia sintetica e quantitativa. Mentre la comunità di ricerca utilizzando TXTL è in rapida crescita e TXTL sta diventando una tecnologia standard in Bioingegneria, è essenziale comprendere come utilizzare tali piattaforme al fine di sviluppare adeguate pratiche relazionate all'esecuzione delle reazioni di TXTL e alla interpretazione dei risultati.
In questo articolo, descriviamo come utilizzare un sistema TXTL di e. coli tutto per sintetizzare, nelle reazioni di uno-pentola, batteriofagi dal loro genoma11, quali MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Vi mostriamo come la quantità di fagi sintetizzata cambiamenti per quanto riguarda alcune delle impostazioni biochimiche delle reazioni (concentrazioni di magnesio e potassio). Affollamento molecolare, emulato attraverso una gamma di PEG 8000 concentrazioni, ha un effetto drammatico sulla sintesi dei fagi parecchi ordini di grandezza. La realizzazione di questi grandi sistemi biochimici nelle reazioni di singola provetta che ricapitolano contemporaneamente i processi di trascrizione, traduzione e auto-assemblaggio, sono interessante per affrontare questioni fondamentali legate alla biologia e biofisica 10 (regolazione genica, self-assembly), come pure per lo sviluppo di applicazioni, ad esempio di riuso funzioni dei fagi per costruire nuove nanostrutture13. Oltre a un pratico su TXTL, sono disponibili metodi per l'amplificazione dei fagi, genoma estrazione e purificazione e quantificazione dei fagi dall'analisi della placca. I metodi presentati in questo manoscritto sono appropriati per i ricercatori che utilizzano sistemi senza cellula basata l'Estratto di e. coli e sono interessati a batteriofagi.
I protocolli presentati in questo lavoro si possono riassumere come segue: amplificazione 1) dei fagi (giorno 1: preparare l'inoculazione cellule, giorno 2: singola placca, più crescita dei fagi e concentrazione e 3 ° giorno: purificazione del fago), 2) estrazione di DNA Double-stranded del genoma (estrazione del fenolo/cloroformio) e 3) senza cellula reazione dei fagi e titolo esperimento (giorno 1: piastra di cellule dell'ospite e rendere le piastre di agar, giorno 2: reazione senza cellula e host cella pre-cultura e il giorno 3: titolo di cultura e dei fagi cellula ospite).

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifugation tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Gradient maker</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Syringe and Blunt Cannula</td><td>Monoject</td><td>8881513918 and 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Wide-bore pipette tips</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Plaque counter</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Colony Counter Model C-110</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Cell-free system</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Model 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB agar plate recipe</td><td></td><td></td><td>25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).</td></tr></tbody></table>

synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system

Una nuova generazione di sistemi senza cellula trascrizione-traduzione (TXTL), progettato per avere una maggiore versatilità e modularità, fornire nuove funzionalità per eseguire delle scienze di base ed applicate in provetta reazioni. Nell'ultimo decennio, senza cellula TXTL è diventata una tecnica potente per un'ampia gamma di biologia related to quantitativa e sintetiche aree di ricerca multidisciplinare romanzo. Le nuove piattaforme TXTL sono particolarmente utili per costruire e interrogare i sistemi biochimici mediante l'esecuzione di circuiti gene sintetico o naturale. In vitro TXTL ha dimostrato conveniente rapidamente elementi regolatori prototipo e reti biologiche anche per quanto riguarda Riepilogo molecolare autoassemblaggio meccanismi trovano nei sistemi viventi. In questo articolo, descriviamo come infettivi batteriofagi, quali MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), interamente sono sintetizzati dal loro genoma in reazioni di uno-pentola usando un tutti Escherichia coli, sistema senza cellula TXTL. Sintesi dei tre fagi sono quantificato utilizzando il saggio della placca. Vi mostriamo come la resa del fago sintetizzato dipende dalle impostazioni delle reazioni biochimiche. Affollamento molecolare, emulato attraverso una controllata concentrazione di PEG 8000, influisce sulla quantità di fagi sintetizzati da ordini di grandezza. Inoltre descriviamo come amplificare i fagi e purificare i loro genomi. L'insieme di protocolli e risultati presentati in questo lavoro dovrebbe essere di interesse per i ricercatori multidisciplinari coinvolti in Bioingegneria e biologia sintetica senza cellula.

Indichiamo quattro risultati rappresentativi. Nella Figura 1, vi presentiamo una serie di controlli negativi per garantire che il sistema TXTL senza cellula e le scorte di DNA dei fagi non sono contaminate con vita cellule di Escherichia coli . Verificare che il sistema TXTL senza cellula è libero di intatto e. coli contaminazione della cellula da placcatura sia una soluzione di reazione non incubate e incubate Sub del DNA genomico (Figura 1A eBdi Figura 1). Se il sistema TXTL senza cellula è stato contaminato con le cellule di Escherichia coli , crescita avrebbe osservato sulla piastra. Inoltre, verifichiamo che la reazione senza cellula e pertanto non tutte le cellule possibili contaminanti, sono responsabili per la sintesi del fago di placcatura reazioni non incubate e incubate con il genoma dei fagi (Figura 1C e Figura 1D). La piastra con la reazione non incubate (Figura 1C) Mostra zero placca, mentre la piastra con la reazione incubata (Figura 1D) Mostra della placca, che indica che il sistema TXTL senza cellula era responsabile dei fagi sintesi.
Nella Figura 2, mettiamo a confronto un omogeneo rispetto al saggio della placca disomogenea. Figura 2 B illustra un gradiente di densità della placca attraverso la piastra di coltura, che è sub-ottima rispetto ad una densità di placca omogenea della piastra in Figura 2A. La fonte di questo osservato è risultato il rapido raffreddamento della master mix di cellule batteriche top agar, campione e host quando erogata su una piastra di coltura durante la parte di titolo dei fagi dell'esperimento. Per evitare una diffusione disomogenea delle placche dei fagi, assicurarsi che le piastre di coltura sono equilibrate a 37 ° C prima di iniziare l'esperimento di titolo dei fagi.
Un passaggio fondamentale per contare correttamente fagi è diluire la soluzione di fago sufficientemente per ottenere tra 50 e 200 placche per piastra (Figura 3). Sotto questa gamma, è difficile determinare le statistiche di vere, e sopra questa gamma, le placche si sovrappongono, impedendo conteggi precisi. Il numero di fagi sintetizzato nel TXTL dipende dalle impostazioni biochimiche, quali la concentrazione di sali (potassio e magnesio), di Crowder molecolari e dei genomi. In Figura 4, vi mostriamo alcuni esempi di test per i fagi T7 e ΦΧ174. Per un fago che replica il suo DNA, come ad esempio T7, si osserva un'alta efficienza di sintesi dei fagi nella reazione senza cellula: tre fagi infettive sono sintetizzati per molecola di genoma nella reazione. Ci si può aspettare una minore efficienza di reazione per un fago che non replica il suo DNA, come ad esempio ΦΧ174: il rapporto del fago sintetizzato infettiva alla molecola del genoma è 1:5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig1.jpg"> 
Figura 1: Placca analisi controlli e produzione dei fagi infettive successo utilizzando un sistema senza cellula reazione (CFR). (A) nessun genoma è stato aggiunto ed è stato effettuato nessun incubazione (0 min come tempo di incubazione) di CFR. La reazione è stata quindi placcata senza host e. coli. Risultato non mostra nessun host praticabile contaminazione delle cellule del CFR. (B) nessun genoma è stato aggiunto e CFR è stato incubato 12h a 29 ° C e placcato senza host e. coli. I risultati non mostrano nessun host praticabile contaminazione delle cellule di CFR, anche dopo incubazione. (C) 1 nM genoma incluso con nessuna incubazione di CFR (0 min come tempo di incubazione) e placcato con host e. coli. Risultato non indica nessuna contaminazione dei fagi della soluzione del genoma. (D) 1 nM genoma incluso e CFR incubate 12 ore a 29 ° C. e placcato con host e. coli. Risultati mostrano replica di successo dei fagi infettive CFR. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56144/56144fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig2.jpg"> 
Figura 2 : Omogeneo contro diffusione disomogenea della reazione dei fagi durante l'esperimento titolo. Un possibile effetto di esecuzione di un titolo dei fagi su piastre di coltura non equilibrati a una temperatura di 37 ° C è la diffusione disomogenea di reazione dei fagi attraverso la piastra di coltura. Un buon risultato visualizzati da una diffusione omogenea di reazione dei fagi è mostrato in (A), dove le placche sono distribuite uniformemente su tutta la superficie della piastra. Viene visualizzato un risultato Sub-ottimo in (B), dove le placche sono concentrate nella parte inferiore sinistra della piastra di coltura. Questo problema può verificarsi con il top-agar, reazione dei fagi e mix master cella di host sono distribuiti su una piastra di coltura che non è ad una temperatura di 37 ° C. La maggior parte del mix master si solidifica nella regione inferiore sinistro, e una diffusione omogenea non è possibile. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56144/56144fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig3.jpg"> 
Figura 3 : L'impostazione di un fattore di diluizione per i titoli di una reazione senza cellula fagica. (A), questo piatto viene visualizzato un numero ragionevolmente numerabile di placche. Il fattore di diluizione utilizzato per la parte di titolo dell'esperimento diluito la resa della reazione dei fagi abbastanza di lasciare un numero numerabile di placche sulla piastra. Al contrario in (B) il fattore di diluizione era troppo basso per quanto riguarda la resa del fago sintetizzato e deve essere regolato. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56144/56144fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig4.jpg"> 
Figura 4 : Caratterizzazione della sintesi senza cellula di fagi ΦΧ174 e T7. (A) numero di ΦΧ174 sintetizzato e T7 fagi (PFU/mL: plaquunità di formazione di e per millilitro) come una funzione di PEG 8000 concentrazione nella reazione senza cellula, misurato dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. (B) numero di ΦΧ174 sintetizzato e T7 fagi in funzione della concentrazione di glutammato di magnesio nella reazione senza cellula, misurata dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. (C) numero del fago sintetizzato ΦΧ174 in funzione della concentrazione del genoma del DNA di ΦΧ174 nella reazione senza cellula, misurato dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. (D) numero di sintetizzato fago T7 in funzione della concentrazione di genoma T7 DNA nella reazione senza cellula, misurato dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. Tutte le barre di errore visualizzate sono deviazioni standard delle tre prove ripetute. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56144/56144fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56144/56144table1.jpg"> 
Tabella 1: composizione reazione. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56144/56144table1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System at JoVE.com

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

synthesis-infectious-bacteriophages-an-e-coli-based-cell-free

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

14.5K Views.  University of Minnesota. Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

Video: Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Biologia

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Chimica

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolli CFPS per cellule sintetiche microcompartimentalizzate

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for the core machinery of the Central Dogma, standing as an optimal chassis for the integration and assembly of diverse artificial cellular mimicry systems. Despite its frequent use in the fabrication of synthetic cells, establishing a tailored and robust CFPS system for a specific application remains a nontrivial challenge. In this methods paper, we present a comprehensive protocol for the CFPS system, routinely employed in constructing synthetic cells. This protocol encompasses key stages in the preparation of the CFPS system, including the cell extract, template preparation, and routine expression optimization utilizing a fluorescent reporter protein. Additionally, we show representative results by encapsulating the CFPS system within various micro-compartments, such as monolayer droplets, double-emulsion vesicles, and chambers situated atop supported lipid bilayers. Finally, we elucidate the critical steps and conditions necessary for the successful assembly of these CFPS systems in distinct environments. We expect that our approach will facilitate the establishment of good working practices among various laboratories within the continuously expanding synthetic cell community, thereby accelerating progress in the field of synthetic cell development.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottimizzazione dei sistemi CFPS per la costruzione di celle sintetiche

This protocol describes the Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system used in constructing synthetic cells. It outlines key stages with representative results in different micro-compartments. The protocol aims to establish best practices for diverse laboratories in the synthetic cell community, advancing progress in synthetic cell development.

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

Biochimica

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Bioingegneria

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolli per l&#39;implementazione di un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

A seguito di Cell-destino

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

Protocolli per l'implementazione di un