Questo protocollo semplifica e chiarisce i metodi per implementare la sintesi auto-proteina da parte di non esperti. Un migliore accesso a questi metodi aiuterà a demarketizzare la piattaforma e l'ampio set di applicazioni che abilita. I principali vantaggi di questa tecnica sono la velocità, il rapporto costo/efficacia e la facilità di reazione impostata rispetto ad altre piattaforme di sintesi auto-proteina.
La nostra piattaforma può abilitare una serie di applicazioni tra cui genomica funzionale, hythopertesting, biosensori, kit educativi e con piccole modifiche, ingegneria metabolica ed espansione del codice genetico. Mentre questa tecnica richiede solo formazione di laboratorio di base, i nuovi utenti dovrebbero pianificare di familiarizzare con tecniche come la sonicazione per un'esecuzione riuscita del protocollo. Per iniziare questa procedura, preparare tutte le celle E.coli dei supporti e delle impostazioni cultura come indicato nel protocollo di testo.
Mettere una bottiglia di centrifuga da un litro in un bagno d'acqua ghiacciata. Una volta che le colture OD600 raggiungono 3.0, versare la coltura cellulare nella bottiglia refrigerata. Utilizzando un bilanciere a doppio fascio, aggiungere acqua a un secondo flacone di centrifuga da un litro fino a quando non pesa lo stesso del primo per creare un equilibrio per la centrifuga.
Dopo aver preraffreddato la centrifuga a quattro gradi Celsius, centrifugare le bottiglie a 5.000 g e a 10 gradi Celsius per 10 minuti per pellettare le celle. Dopo questo, versare lentamente e smaltire il supernatante. Posizionare il pellet di cella sul ghiaccio.
Utilizzando una spatola sterile raschiare il pellet cellulare dalla bottiglia di centrifuga e trasferirlo in un tubo conico freddo da 50 millilitri. Aggiungere 30 millilitri di tampone S30 freddo integrato con due DTT millimolare e rimorsi il pellet a vortice in brevi raffiche con periodi di riposo sul ghiaccio fino a quando il pellet non viene completamente rimorsinato senza pezzi. Successivamente, utilizzare un altro tubo conico di 50 millimetri riempito con acqua come equilibrio per centrifugare il campione a 5.000 g e 10 gradi Celsius per 10 minuti.
Versare e smaltire il supernatante. Resuspend il pellet con tampone S30 freddo da 20 a 25 millilitri. Centrifuga a 5.000 g e a 10 gradi Celsius per 10 minuti.
Versare e smaltire il supernatante. Quindi, aggiungere 30 millilitri di tampone S30 e rimosogliere il pellet utilizzando un vortice come descritto in precedenza. Impostare tre tubi conici pre-pesati, freddi e da 50 millilitri.
Utilizzando un riempitivo sierologico pipetta con pipetta sterile, aliquota dieci 10 millilitri di sospensione pellet in ogni tubo. Centrifugare tutti i tubi utilizzando bilanci appropriati in base alle esigenze a 5.000 g e 10 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo questo, versare e smaltire i supernatanti.
Pulire con cura l'interno di ogni tubo e cappuccio con un tessuto pulito per rimuovere il buffer di accesso, assicurandosi di evitare di toccare il pellet. Utilizzando un bilanciere analitico, riaspesti i tubi e segnala il peso finale del pellet per ogni tubo. Per iniziare, aggiungere un millilitro di tampone S30 freddo con 2 DTT millimolare per grammo di massa cellulare ad ogni pellet.
Utilizzare un vortice per rimospendare i pellet come descritto in precedenza. Quindi trasferire 1,4 millilitri di ogni pellet rimescolato in tubi microcentrifugi separati da 1,5 millilitri. Posizionare un tubo in un bagno d'acqua ghiacciata in un becher e posizionare la sonda sonicatore in modo che non tocchi i fondi o i lati del tubo.
Sonicare il tubo con l'ampiezza impostata al 50% per 45 secondi, seguita da 59 secondi di riposo. Assicurarsi di chiudere e invertire i tubi durante i periodi di spegnimento. Subito dopo il completamento della sonicazione, aggiungere 4,5 microlitri di un DTT molare nel litorato.
Invertire il tubo più volte per mescolare e quindi posizionarlo sul ghiaccio. Ripetere questo processo, sonicando e aggiungendo DTT per ogni tubo di celle rimontente. Centrifugare i campioni a 18.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Successivamente, pipettare ogni supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri, lasciandosi alle spalle un supernatante per assicurarsi che il pellet non sia disturbato. Portare i tubi di supernatante sulla piattaforma di scuotimento di un incubatore e incubarli a 37 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min per 60 minuti. Questa è la reazione al ballottaggio.
Quindi, centrifugare i campioni a 10.000 g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere ogni supernatante senza disturbare il pellet trasferendoli in nuovi tubi. Creare molte aliquote da 100 microliter dell'estratto per la conservazione.
In primo luogo, la soluzione di disgelo A, la soluzione B, il modello di DNA, l'estratto BL21DE3, la T7 RNA Polimerasi e un'aliquota di acqua di grado molecolare sul ghiaccio. In secondo luogo, etichettare la quantità necessaria di tubi di microcentrifugo necessari per la reazione CFPS. Mescolare ogni reagente pipettando o vortexing, quindi aggiungere la soluzione al tubo di reazione etichettato, assicurandosi di non vortice l'estratto di cella ma invece invertire il tubo per mescolare.
Assicurarsi che la reazione finale sia ben miscelata e combinarsi in un'unica perla da 15 microliter nella parte inferiore di ogni tubo. Incubare ogni reazione senza tremare a 37 gradi Celsius per quattro ore o a 30 gradi Celsius durante la notte. Per iniziare, ottenere una piastra di pozzo 96 e caricare 48 microlitri di HEPES molare 0,05 a pH 8 in ogni pozzo necessario per la quantificazione.
Quindi, rimuovere i tubi di reazione dall'incubatore. Mescolare ogni reazione tubazione su e giù e trasferire due microlitri di ciascuna reazione nei pozzi contenenti HEPES. Mescolare ogni bene pipettando su e giù.
Dopo che tutte le reazioni sono state caricate e mescolate, caricare la piastra in un fluorometro e misurare le fluorescenti del punto finale SFGFP utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 510 nanometri. Utilizzare una curva standard generata in precedenza per determinare la concentrazione di GFP superfoldered dalla lettura fluorescente ottenuta. In questo studio viene studiata una preparazione dell'estratto di E.coli basata sulla sonicazione.
Pellet cellulari ed estratto cellulare sono stabili a -80 gradi Celsius per almeno un anno. Inoltre, l'estratto cellulare può subire almeno cinque cicli di congelamento-scongelamento senza una significativa perdita di produttività. Alcuni passaggi all'interno di questo protocollo possono essere variati senza pregiudicare la produttività complessiva del sistema.
In particolare, le cellule possono essere raccolte nell'intervallo da 2,7 a 4,0 densità ottica a 600 nanometri senza un effetto significativo sulla produttività dell'estratto cellulare. Tuttavia, la qualità del DNA modello è una fonte di variabilità da lotto a lotto che influisce sulle rese volumetriche della reazione CFPS. Questo si risolve purificando il DNA attraverso un Midi o Maxiprep seguito da un ulteriore passaggio di pulizia del DNA.
Il recipiente di reazione influisce anche sulle rese volumetriche della reazione CFPS. Un aumento del rapporto superficie/volume, si traduce in rese volumetriche più elevate. Per ottimizzare le rese volumetriche della reazione CFPS e ridurre la variabilità da lotto a lotto dell'estratto cellulare, è necessario eseguire una titolazione di magnesio per ogni nuova preparazione dell'estratto.
Per gli estratti cellulari composti da 30 milligrammi per proteina totale millilitro, la concentrazione ottimale di magnesio e il volume di estratto per ridurre al minimo l'uso di reagenti e massimizzare la resa volumetrica è rispettivamente di 10 millimolare e cinque microlitri. Variando la scala di reazione, gli utenti possono perseguire metodi che vanno dallo screening ad alta produttività alle espressioni su larga scala di una proteina bersaglio. Questa tecnica offre due vantaggi chiave, prima scherma i prodotti proteici più rapidamente e, in secondo luogo, sintetizza proteine difficili da esprimere.
Esempi includono proteine che sono citotossiche o richiedono condizioni ossidanti per la loro funzione. Come per qualsiasi procedura di laboratorio, tutti i reagenti devono essere trattati con cautela. Inoltre, le centrifughe devono sempre essere bilanciate e la protezione dell'orecchio deve essere utilizzata durante la sonicazione.
