Name: visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model at JoVE.com

TB riconosce un assegno di ricerca da Fibrosi Cistica Canada.

Si noti che la ricerca Consiglio di etica (REB) è necessario per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani. Questi studi sono stati approvati dal Hospital for Sick Children REB # 1.000.019,444 mila. 1. preparazione dei campioni dell&#39;espettorato CF <ol><li> Raccogliere campione di espettorato dai pazienti durante le visite di routine alla clinica fibrosi cistica e tenere in ghiaccio. </li><li> Trasporto del campione di espettorato sul ghiaccio entro la prima ora di raccolta, al laboratorio di ricerca, di sottoporsi a trattamento. </li></ol> 2. dell&#39;espettorato Processing <ol><li> Registrare il volume del campione di espettorato ottenuti. Aggiungere tampone fosfato salino (PBS) per 2 volte il volume del campione (ad esempio, 2 parti di PBS, 1 parte di campione). </li><li> Mescolare il campione bene con una pipetta di trasferimento. Vortex il campione sul valore massimo per 1 minuto per miscelare completamente. </li><li> Aliquota 1 ml della miscela sopra nel numero provette da 1,5 ml microcentrifuga appropriati e spin down a 5.000 xg per20 min a 4 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e scartare il pellet. </li><li> Filtro sterilizzare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron e raccogliere in una provetta pulita. NOTA: La sterilità del filtrato viene testato da placcatura su LB agar e inoculando mezzi liquidi. </li><li> Conservare il surnatante dell&#39;espettorato a -80 ° C per un uso futuro. NOTA: L&#39;espettorato da più pazienti possono anche essere raggruppati dopo la filtrazione. </li><li> Prima dell&#39;uso, diluire espettorato filtrato 1/10 v / v (100 ml di espettorato, 900 l di media) a supporto desiderato. NOTA: Qui, è stato utilizzato il brodo lisogenia standard (LB) media. </li></ol> 3. Metodo Chambered coprioggetti per la formazione di biofilm <ol><li> Crescere isolato batterico di interesse overnight a supporto desiderato a 37 ° C con agitazione (200 rpm). Nota: sono stati utilizzati una serie di diversi batteri, tra isolati clinici Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complesso Burkholderia cepacia e xylosoxidans Achromobacter. Scelta dei supporti dipende dalle tensioni e le condizioni di interesse, ma i media LB possono essere utilizzati per gli esperimenti iniziali. </li><li> Dalla cultura overnight, inserire 40 ml di coltura in 4 ml di mezzi freschi e crescere per 3-4 ore a 37 ° C con agitazione (200 rpm) per ottenere una coltura con una densità ottica a 600 nm (OD 600) di circa 0,5 -0.6. </li><li> Diluire la cultura dal punto 3.2 a 1/5 nel supporto desiderato con il 10% espettorato filtrato o senza filtrato espettorato (come controllo). Altro concentrazione di espettorato filtrato può essere testato (cioè, 50% o 100%). </li><li> Utilizzare 200 ml di diluizione per seminare pozzi di camere di diapositive. </li><li> Permettere ai batteri di attaccare per 4 ore a 37 ° C senza agitazione. </li><li> Dopo 4 ore, rimuovere il supporto e lavare delicatamente il biofilm con mezzi freschi 1x. Sostituire con 200 ml di mezzi freschi. NOTA: Per studiare gli effetti della sputo sul biofilm, i fresh media dovrebbero contenere espettorato surnatante. </li><li> Consentire biofilm di crescere per quantità desiderata di tempo a 37 ° C senza agitazione, sostituirà supporti ogni 12 ore, senza lavaggio fino al momento per microscopia. NOTA: Per studiare l&#39;effetto dei sovranatanti di espettorato su biofilm sensibilità agli antibiotici, gli antibiotici vengono aggiunti ai media dopo 24 ore di crescita di biofilm e sono mantenute nella media fino a quando la colorazione e l&#39;imaging di biofilm. </li></ol> 4. colorazione biofilm e Microscopia confocale <ol><li> Dopo il tempo di crescita desiderato (24-48 hr funziona meglio), rimuovere i supporti da pozzi da camera e lavare delicatamente ciascuna camera due volte con 300 ml di PBS sterile. </li><li> Preparare la miscela di colorazione per biofilm mescolando 1 ml di ciascun colorante (fornito nel kit fattibilità) per ogni ml di soluzione necessaria. Fai la tintura in acqua o mezzi soluzione. NOTA: L&#39;acqua è consigliato dal produttore. </li><li> Aggiungere 200 ul di miscela colorante in ciascun pozzetto della covergla chamberedss ed incubare a temperatura ambiente, al buio per 45 min. </li><li> Rimuovere miscela colorazione dalle camere e lavare bene ogni con 300 ml di PBS sterile. Rimuovere PBS e sostituirlo con acqua dolce o media. </li><li> Procedere con la visualizzazione di biofilm mediante microscopia confocale. </li></ol> 5. Visualizzazione biofilm con Microscopia confocale <ol><li> Leggi biofilm macchiati in camere immediatamente dopo la colorazione (entro 1 ora). Minimizzare ritardo nella visualizzazione delle diapositive colorando 1 a 2 camere 8 pozzetti alla volta. </li><li> Eseguire l&#39;imaging utilizzando microscopio confocale con i laser per l&#39;eccitazione e di filtro set per l&#39;acquisizione. NOTA: Qui, il disco di sistema confocale di filatura con i laser Borealis spettrali (Verde: 491nm, colore rosso: 561 nm) sono stati utilizzati per l&#39;eccitazione. filtro per le emissioni set di 515/40 e 624/40 sono stati usati per visualizzare le macchie dal kit biofilm viabilità. </li><li> Prendere le immagini utilizzando un obiettivo 25X acqua sul microscopio confocale con la macchina fotografica. </li><li&gt; Usa Z-Stack per modellare il biofilm. Prendere immagini ogni 0,5-1 micron a partire dal primo piano di messa a fuoco per l&#39;ultimo fotogramma di messa a fuoco del biofilm (in genere si estende 30-80 micron per 48 biofilm hr) </li><li> Prendere 3-5 immagini da ogni pozzetto. NOTA: Così per un 8 coprioggetti ben camerata, 24-40 immagini saranno generate. </li><li> Salvare le immagini per l&#39;analisi. NOTA: Le immagini devono essere salvati come file OME-TIFF per essere analizzati utilizzando COMSTAT 18,19. Istruzioni per l&#39;analisi delle immagini biofilm possono essere trovati a http://www.comstat.dk/. Una volta che le immagini vengono importate, parametri come spessore medio, biomassa e la copertura di superficie per ogni canale (rosso e verde) possono essere analizzati. </li></ol>

<ol>
	<li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+with+biofilm+formation:+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy.">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giving+structure+to+the+biofilm+matrix:+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes.">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li><li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Microbial+coaggregation:+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development.">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation:+a+clinically+relevant+microbiological+process.">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario,+Canada.">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li><li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis.">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li><li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells.">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa.">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li><li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses.">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).</li><li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li><li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms.">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li><li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients.">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide.">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).</li></ol>

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dei biofilm batterici cresciute in presenza di prodotti esogeni. Non sorprendentemente, la produzione dei exoproducts è di importanza quando si utilizza questo tipo di sistema. Per esempio, ditiotreitolo (DTT), è spesso usato su campioni di espettorato umani per aiutare a liquefare i campioni. Tuttavia, l&#39;effetto di DTT solo può diminuire sviluppo biofilm e vitalità (dati non mostrati). Quindi, controlli appropriati per tutte le condizioni sono necessarie. Inoltre, l&#39;aggiunta di prodotti dell&#39;espettorato umani crea variabilità intrinseca l&#39;esperimento a causa del fatto che l&#39;espettorato di ogni paziente ha una microbiome unico. Per regolare per questo, abbiamo utilizzato campioni di espettorato in pool per evitare risultati specifici del paziente. Inoltre, la scelta di appropriati mezzi è importante quando si usa un sistema modello. supporti standard per la crescita di biofilm dell&#39;organismo previsto sono consigliate per la configurazione iniziale del sistema. Se l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento è quello di identIfy come i prodotti esogeni stanno interessando la formazione di biofilm, un nutriente rich media che fornisce un&#39;adeguata formazione di biofilm è suggerito. Questo permetterà la nutrizione sufficiente per la crescita, pur determinare come i fattori esogeni possono influenzare il biofilm. Altri media, quali mezzi minimali o definiti, possono essere utilizzate a determinate condizioni migliori mimici. Altri media sono stati utilizzati con buoni risultati in questo sistema (dati non mostrati). L&#39;attaccamento dei biofilm al coprioggetti camerati è robusto, per quanto grande cura deve essere presa durante la rimozione / aggiunta di supporto o durante le fasi di lavaggio dei biofilm per evitare che interrompere i biofilm. L&#39;uso della macchia live-morti secondo il protocollo del produttore ha dato buoni risultati per il sistema descritto. Un certo numero di fattori che possono influenzare il rapporto di fluorescenza delle immagini (compresa colorante assorbimento di batteri, densità relativa di impostazioni biofilm e di guadagno del rivelatore), tuttavia, questo metodo dovrebbe riferirsi a quanto osservato nell&#39;immagineS. Altre misure potrebbero essere usate per rappresentare la quantità relativa di morti biofilm / live, come la biomassa dalle cellule morte come rapporto tra la biomassa totale presente nel biofilm (come derivato da COMSTAT). Utilizzando conta batterica per confermare la vitalità del biofilm in esperimenti ripetuti si consiglia di confermare le osservazioni visive di questo modello. A causa della eterogeneità del biofilm, immagini multiple da ciascuna camera e camere multiple devono essere utilizzati per ciascuna condizione in un esperimento. Ciò aumenta il costo e la durata di questi esperimenti. L&#39;acquisizione delle immagini è importante prima dell&#39;analisi dei dati di questi esperimenti. Bisogna fare attenzione a non saturare le immagini e quando si determina la configurazione microscopio. A seconda del livello di dettaglio richiesto e il microscopio disponibili, diversi obiettivi (10X, 25X, 40X e 63X) può essere usata per acquisire immagini, anche se si trova che obiettivo 25X fornisce immagini migliori. Lo spessore tegli Z-stack può anche influire sulla qualità dell&#39;immagine e livello di dettaglio. Avere immagini scattate ogni 0,5-1 micron sembra fornire immagini nitide a 25X obiettivo, pur mantenendo le immagini Z-stack in un formato che può essere analizzato da COMSTAT su sistemi di computer standard. Questi esperimenti sono più costose e lunghe di altri saggi di fissaggio, e non può essere fatto in modo elevato throughput. In questa procedura, i batteri attaccano ad una superficie borosilicato, che non è riflettente di una condizione in vivo e può influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Tuttavia, essi forniscono informazioni aggiuntive e in grado di generare ipotesi di meccanismo relative al biofilm resistenza agli antibiotici e la risposta fisiologica al segnale esogeno. Se l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento è quello di capire come biofilm cambiano in risposta a diversi fattori, piuttosto che identificare composti anti-biofilm utilizzando metodi high-throughput per esempio, le informazioni aggiuntive acquisite utilizzando tla sua tecnica rende il metodo utile. Pertanto, il metodo attuale è un avanzamento significativo rispetto ai precedenti test fissaggio limitate, come il test cristalvioletto, che è più comunemente utilizzato per studiare biofilm. I passaggi critici di questa procedura sono: 1) Assicurare il trattamento tempestivo dei campioni di espettorato per evitare il degrado; 2) Essere gentile con i cambiamenti dei media sui biofilm per evitare perturbazioni del biofilm e 3) fare misurazioni ripetute di immagini biofilm al fine di garantire una rappresentazione accurata dello spessore biofilm a causa della eterogeneità della formazione di biofilm. Una volta che il sistema è predisposto per una determinata specie batteriche, si può verificare un certo numero di differenti condizioni, inclusi gli effetti di fattori esogeni su diversi isolati clinici. Questo sistema è stato utilizzato per studiare l&#39;effetto degli antibiotici sui biofilm esposto a espettorato umano 16 e di confrontare isolati clinici alta resistenza e resistenti intermedia. 17 Modifiche coprioggetti incamerata, come rivestimento basso con mucina o collagene micro-scaffold (ad esempio, puracol), possono estendere ulteriormente la gamma di esperimenti possibili. Può essere possibile adattare questo sistema per studiare le interazioni dirette, come quelle tra le cellule epiteliali e batteri, o tra diverse specie batteriche. Questo è un&#39;espansione del modello descritto da Jurcisek et al. 20 Il metodo utilizza crescita camera di scorrimento simile a quella descritta qui e utilizza formalina per fissare biofilm prima visualizzazione. In alternativa, in questo metodo visualizziamo biofilm subito dopo la colorazione e non usiamo un fissativo. Inoltre, aggiungiamo fattori esogeni per testare l&#39;effetto di antibiotici su biofilm. Questo modello ha quindi le potenzialità per favorire notevolmente la nostra comprensione dei biofilm batterici nelle malattie umane.

biofilm batterici sono gruppi di microrganismi che sono attaccati l&#39;uno all&#39;altro e racchiuso in una matrice di auto-secreta. 1,2 Classicamente, rappresentano i batteri fisicamente collegati a una superficie abiotico o biotico formata in condizioni di flusso. I biofilm hanno anche dimostrato di crescere in condizioni statiche (assenza di flusso) e distale da superfici, come ad esempio all&#39;interfaccia aria-liquido di piscine termali o pellicole formate in provetta. Questi biofilm sono da tempo riconosciuti nell&#39;ambiente e sono un grande danno per processi industriali, in quanto possono formare in serbatoi di acqua o in tubi, con conseguente biofouling, corrosione e blocchi. 3,4 I biofilm sono anche critici in ambienti sanitari, in quanto è stato dimostrato essere coinvolti nelle infezioni correlate al catetere, infezioni polmonari nei pazienti affetti da fibrosi cistica, così come in numerose altre infezioni. 5,6 Una delle caratteristiche di infezioni biofilm è la desgualcita sensibilità dei batteri agli antibiotici e compromessa rinvio del sistema immunitario innato. 7-9 Il più studiati, scenari clinicamente rilevanti che coinvolgono infezione biofilm-based si verifica in pazienti affetti da fibrosi cistica (FC), che sono cronicamente infettati con Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa può subire una serie di modifiche durante la creazione di infezione cronica che lo rendono molto difficile da trattare. 10,11 I biofilm possono differenziale attivare l&#39;immunità innata e guidare l&#39;infiammazione. 12-14 Poiché queste infezioni portano ad un aumento della morbilità e mortalità nei pazienti con FC, è fondamentale per capire i fattori che possono influenzare lo sviluppo del biofilm in questo contesto. Un recente studio suggerisce che ospitano-fattori critici nella formazione di P. aeruginosa aggregati biofilm. 15 Questi biofilm contribuiscono alla ridotta sensibilità agli antibiotici e meccanismi di difesa dell&#39;ospite. il PreseSNO di fattori dell&#39;ospite-derivati, come elastasi neutrofila, così come i prodotti secreti da microrganismi presenti nel polmone CF, hanno il potenziale di modulare notevolmente la formazione di biofilm e sviluppo. 16 Inoltre, biofilm interagiscono con l&#39;host di modulare l&#39;espressione di numerosi percorsi e avviare l&#39;infiammazione. Mentre i metodi high throughput, quali il test cristalvioletto standard possono fornire alcune informazioni per quanto riguarda il processo di biofilm, visualizzazione del biofilm in risposta a questi fattori fornire informazioni più approfondite. In questo manoscritto si descrive un metodo per l&#39;utilizzo di fattori dalla nell&#39;espettorato di pazienti con FC per studiare lo sviluppo di biofilm in vitro. Questo metodo consente la visualizzazione rapida dei biofilm esposti a espettorato contenente fattori host utilizzando un kit di biofilm redditività commerciale. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare visivamente i cambiamenti che si verificano durante la crescita di biofilm in presenza di exogenonoi prodotti, e rappresenta un metodo migliore per analizzare i cambiamenti nello sviluppo del biofilm in varie condizioni.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Availble software online</td><td></td><td>COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Standard media for overnight gowth/biofilm growth</td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtering of sputum supernants</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Washing of biofilm chambers after media removal</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model

I biofilm sono costituiti da gruppi di batteri racchiusi in una matrice di auto-secreto. Essi svolgono un ruolo importante nella contaminazione industriale e nello sviluppo e la persistenza di molte infezioni salute correlati. Uno dei biofilm più ben descritti e studiati nelle malattie umane avviene in infezione cronica polmonare dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Studiando biofilm nel contesto dell&#39;ospite, molti fattori possono influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Al fine di individuare come fattori dell&#39;ospite possono influenzare la formazione di biofilm e sviluppo, abbiamo usato un metodo coprioggetti Chambered statica a crescere biofilm in presenza di fattori dell&#39;ospite-derivati ​​in forma di surnatanti espettorato. I batteri sono seminate nelle camere e esposti a filtrati espettorato. Dopo 48 ore di crescita, biofilm sono macchiate di un biofilm kit commerciale viabilità prima di microscopia e analisi confocale. A seguito di acquisizione delle immagini, le proprietà biofilm possono essere valutati utilizzando piattaforme software differenti.Questo metodo ci permette di visualizzare le proprietà principali della crescita di biofilm in presenza di sostanze diverse, tra cui antibiotici.

Il disegno complessivo di questo esperimento è rappresentata in figura 1. L&#39;uso di questo protocollo fornisce un metodo conveniente per visualizzare le variazioni di biofilm coltivate per diversi periodi di tempo (ad esempio, 24, 48 o 72 hr). È importante sottolineare che i segnali esogeni, quali espettorato filtrati, possono essere aggiunti per visualizzare i cambiamenti nello sviluppo biofilm. Come si vede nella figura 2, la presenza del 10% filtrati dell&#39;espettorato può cambiare l&#39;architettura del biofilm (Figura 2A, pannelli inferiori). 16 Queste immagini possono essere analizzati utilizzando il software COMSTAT per ottenere matrici biofilm chiave, tra cui spessore medio del biofilm, biomassa totale e la copertura della superficie. Ciò si riflette in un aumento globale spessore biofilm (Figure 2B e 3). 16 Gli effetti degli antibiotici sulla biofilm nell&#39;espettorato presenza è illustrato nella figura 3. Con visuali<html> zing i cambiamenti nello sviluppo del biofilm, si può meglio apprezzare come fattori possono influenzare la crescita biofilm, in misura molto meglio di saggi biofilm tradizionali, come macchie cristalvioletto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig1.jpg" /> Figura 1: Disegno generale di esperimento. Diagramma di flusso di protocollo di base. Una notte (O / N) cultura viene diluito 1 / 1.000 e permesso di crescere ad un diametro finale 600 del 0.5. Questo viene ulteriormente diluito 1 / 1.000 e 200 ml è seminato in pozzo di coprioggetti a camera e ha permesso di collegare per 3-4 ore. A seguito di questo, il supporto viene rimosso e sostituito con mezzi freschi. I biofilm sono autorizzati a crescere per il tempo desiderato. Media, prodotti esogeni o antibiotici possono essere aggiunti ai biofilm. A seguito della crescita, i media viene rimosso, biofilm sono macchiati e viene eseguita confocale.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig2.jpg" /> Figura 2: Immagini rappresentative di sviluppo del biofilm a seguito di esposizione a filtrati espettorato. (A) Immagini rappresentative della Burkholderia cepacia (BCC) isolati clinici seguenti 48 ore di crescita in coprioggetti a camera con le sole (pannelli superiori) dei media o in presenza di 10 filtrati% di espettorato (pannelli inferiori) seguita da colorazione con kit di biofilm viabilità. 1 unità scala rappresentano 19.68 micron. (B - C) Spessore medio di isolati (B) e morti: rapporto vivo (C) delle immagini multiple di BCC isolati coltivato per 48 ore in camera di diapositive in assenza (barre bianche) o presenza (barre nere) di espettorato filtrati. Ogni barra rappresenta la media di 45 immagini tracciatecon l&#39;errore standard della media. ** P &lt;0,001 rispetto al controllo (supporti da solo) utilizzando test di Kruskal-Wallis. Figura adattato da Kennedy et al. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54819/54819fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig3.jpg" /> Figura 3: Immagini rappresentative della terapia antibiotica su biofilm esposti al filtrato espettorato. (A) Immagini di isolati clinici Burkholderia vietnamiensis dopo 48 ore di crescita in coprioggetti a camera con i soli mezzi di comunicazione (a sinistra) o in presenza di 10% filtrati espettorato (a destra) con o senza 1.000 mg / m di tobramicina. I biofilm sono state coltivate per 24 ore in mezzi da solo o multimediale integrato con il 10% (v / v) espettorato filtrati. Dopo 24 ore, i media è stato rimosso e sostituito con mediun (+/- espettorato) contenenti antibiotici. 1 unità scala rappresentano 19.68 micron. (B - C) Spessore medio di isolati (B) e morti: rapporto vivo (C) di immagini multiple (n = 9) di B. vietnamiensis isolati coltivato per 48 ore in camera di diapositive in assenza o presenza di espettorato filtrati. Ogni barra rappresenta la media di 45 immagini tracciate con l&#39;errore standard della media. ** P &lt;0,001 rispetto al controllo (0 mg / ml) mediante test di Kruskal-Wallis. Figura adattato da Kennedy et al. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54819/54819fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model at JoVE.com

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.3K Views.  Hospital for Sick Children. This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Video: Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Bioingegneria

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video