Questa ricerca è stata sostenuta dal Naval Medical Research Center, la ricerca unità di lavoro 6000.RAD1.J.A0310. Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente la politica ufficiale o la posizione del Dipartimento della Marina, Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti. Wei-Mei Ching è un dipendente del governo degli Stati Uniti. Questo lavoro è stato preparato come parte dei suoi doveri d&#39;ufficio. Titolo 17 USC §105 prevede che &#39;La protezione del copyright sotto questo titolo non è disponibile per qualsiasi lavoro del governo degli Stati Uniti.&#39; Titolo 17 USC §101 definisce un lavoro del governo degli Stati Uniti come un lavoro preparato dal membro del servizio militare o dipendente del governo degli Stati Uniti, come parte delle funzioni ufficiali di quella persona.

1. Preparare plasmidi DNA diluizioni come standard per LAMP Reazione <ol><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica (OD) a 260 nm per determinare il plasmide (contenente gene target IS1111a di C. burnetii RSA 493) concentrazione di DNA. Un OD 260 di 1 equivale a 50 mg / mL di DNA. </li><li> Convertire la quantità di DNA plasmide nel numero di copie. Poiché la dimensione del plasmide è 6.330 bp, il peso molecolare di questo plasmide è 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). La concentrazione di DNA del plasmide è 34,2 ng / ml (come determinato dal punto 1.1). 1 ml di questo campione di DNA contiene 34,2 ng di DNA plasmide, pari a 5 x 10 9 copie (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) di DNA. </li><li> Aggiungere 10 ml di DNA plasmidico (5 x 10 9 copie / ml) a 90 ml di acqua per una diluizione di 10 volte per fare un campione di DNA di 5 x 10 8 copie / ml. </li><li> Ripetere passaggio 1.3 per preparare campioni di DNA di 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 e 5 x 10 0 copie / ul. </li></ol> 2. Preparare modello di DNA da campioni per la lampada di reazione <ol><li> Eseguire l&#39;estrazione del DNA da campioni di plasma umano utilizzando un kit mini DNA commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare un totale di 200 campioni microlitri per l&#39;estrazione ed eluire DNA estratto in un volume di 20 ml. </li></ol> 3. Preparare 2x Buffer LAMP Reazione <ol><li> Mescolare 200 ml di 10x Pol Buffer, 320 ml di 5 M trimetilglicina, 12 ml di 1 M MgSO 4, 280 ml ​​di miscela dNTP (10 mm ciascuno) e 188 microlitri di acqua per fare 1 ml di tampone 2x LAMP. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi. </li></ol> 4. Eseguire lampada standard di reazione <ol><li> Mescolare 12,5 ml di 2x LATampone MP (come preparato al punto 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetilglicina, 1.4 mM miscela dNTP), 1,2 ml di miscela di primer, 1 ml di polimerasi Bst DNA (8 U / ml), e 5,3 l di acqua per fare miscela di reazione (20 ml) in un tubo di 0,2 ml PCR. </li><li> Aggiungere 5 ml di DNA (dal punto 1 o 2) alla miscela di reazione di 20 microlitri e mescolare bene. </li><li> Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento. Questa è la temperatura di reazione ottimale determinata in precedenza. </li><li> Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione. </li><li> Carico 5 microlitri di prodotti di reazione di un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell&#39;acido nucleico. </li><li> Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE. </li><li> Visualizzare i risultati di raggi UV. </li></ol> 5. Eseguire Reazione lampada con ricostituitoreagenti <ol><li> Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO 4, 667.5 ml di acqua per fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi. </li><li> Rimuovere i tubi che contengono i reagenti liofilizzati dal sacchetto di alluminio sigillato. Non utilizzare i tubi se la borsa foglio di alluminio non è sigillato o se è danneggiato. </li><li> Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione in ciascuna provetta per risospendere reagenti liofilizzati. </li><li> Mescolare pipettando tampone su e giù per 5 volte. Date un&#39;occhiata per assicurarsi che i reagenti liofilizzati sono completamente ri-sospesi. La polvere bianca dovrebbe scomparire nel tubo. </li><li> Aggiungere 5 ml di DNA stampo (dal punto 1 o 2) per i reagenti ricostituiti e mescolare bene. </li><li> Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento. </li><li> Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione. </li><li> Carico 5 ml di reazioneprodotti ad un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell&#39;acido nucleico. </li><li> Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE. </li><li> Visualizzare i risultati di raggi UV. </li></ol> 6. Eseguire LAMP Reazione con tampone di ricostituzione contenenti HNB o fluorescente intercalante Dye <ol><li> Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO 4, 7,5 ml di 20 mm HNB (o 12,5 ml di 100x fluorescente intercalante colorante) e 660 ml (o 655 ml) di acqua a fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi. </li><li> Utilizzare il buffer ricostituito preparato nella sezione 6 di ripetere i passi 5.2 - 5.6. </li><li> Visualizzare i risultati ad occhio nudo (reazione contenente HNB) o una luce UV (reazione contenente colorante intercalante fluorescente). </li></ol> 7. Eseguire in tempo reale reazione lampada con tubo Scanner <ol><li> Aggiungere 5 microlitri DNA alla reconstitutreagenti ED contenenti colorante fluorescente intercalante, chiudere il tubo e inserirlo allo scanner tubo. </li><li> Impostare temperatura di incubazione a 60 ° C. Misurare la fluorescenza a 520 nm per 60 min. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In precedenza, abbiamo sviluppato un saggio LAMP sensibile e specifico mira l&#39;elemento di inserimento IS1111a 14. L&#39;elemento IS1111 è stato scelto perché è altamente conservata tra i diversi ceppi di C. burnetii e il suo alto numero di copie (7-110) nei batteri (Klee 2006). I nostri risultati hanno mostrato che LAMP può rilevare circa 25 copie dell&#39;elemento IS1111, che può correlare il meno una copia cromosomale di Coxiella DNA. In questo studio, polimerasi Bst DNA, primer lampada e dNTP state liofilizzate e confezionati in un sacchetto di carta stagnola con zip. La sensibilità di questi reagenti liofilizzati rimane a 25 copie; simile ai reagenti appena preparati per almeno un mese se conservato a temperatura ambiente. E &#39;molto importante assicurarsi che la borsa foglio di alluminio è adeguatamente sigillato prima di aprirlo. Non utilizzare i tubi se la borsa foglio di alluminio non è sigillato o se è danneggiato. Ciò può causare la reidratazione of i reagenti liofilizzati che porta alla perdita della sua reattività. L&#39;altro punto critico è la risospensione dei reagenti liofilizzati con tampone di ricostituzione. La reazione lampada non funziona correttamente con i reagenti che non sono completamente ri-sospesi. A causa delle alte concentrazioni di sale del tampone di reazione e l&#39;alta viscosità della soluzione trimetilglicina, non possono essere liofilizzate successo con polimerasi Bst DNA, primer LAMP, e dNTP. Un passo speciale è necessaria per preparare il buffer di ricostituzione con tali componenti. Potenzialmente la reazione lampada può essere testato a basse concentrazioni di sale a basso o nullo trimetilglicina. Se vi è una condizione reazione che ha la stessa sensibilità di rilevamento, ma con bassa concentrazione di sale e bassa trimetilglicina, il reagente liofilizzato deve solo essere ricostituito con acqua. Ciò semplificare ulteriormente le fasi di reazione. Recentemente, Wang et al. 15 rispetto dodicisaggi LAMP-house con il commercializzato isotermico kit Master Mix ed ha trovato le analisi in-house sono risultati falsi-positivi. Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato diversi saggi lampada per la rilevazione di batteri diversi e non hanno mai trovato risultati falsi positivi in ​​questi test in-house. Inoltre, nelle fasi iniziali dello sviluppo del metodo LAMP, i saggi sono stati testati sia in-house preparato mix master e master mix commercializzato e nessuna differenza è stata osservata nella sensibilità e specificità dei saggi &#39;. Il nostro studio presenta anche diversi metodi che non solo in grado di rilevare i prodotti LAMP senza aprire le provette di reazione per diminuire la probabilità di contaminazione incrociata di laboratorio, ma hanno anche un tempo di processo più breve per leggere risultati si raffrontano con metodo gel elettroforesi. Il vantaggio di utilizzare questi metodi di rilevamento permetterà di migliorare notevolmente la nostra capacità di eseguire rapidamente il test e diagnosticare un individuo con C. burnetii </em&gt; infezione nelle aree con risorse limitate. Questo permetterà trattamento rapido e appropriato di febbre Q acuta e diminuire il potenziale del futuro infezione cronica. A differenza dei metodi basati sulla PCR in cui è necessario un termociclatore, un blocco di riscaldamento, bagno d&#39;acqua o incubatore mantenendo una temperatura costante di circa 60 ° C è tutto ciò che è necessario per il test LAMP. Questo rende il saggio particolarmente adatto in ambiente risorse limitate. A differenza del saggio originale LAMP, polimerasi Bst DNA, primer lampada e dNTP devono essere conservati a -20 ° C. Questi reagenti liofilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente, il che rende ancora più utile per un ambiente di risorse limitate, dove la febbre Q è endemica. Lo studio di stabilità a lungo termine dei reagenti liofilizzati a 4 ° C, 25 ° C e 37 ° C è attualmente in corso. In futuro, vorremmo dimostrare che questo test LAMP utilizzando reagenti liofilizzati in grado di rilevare C. burnetii con sensibilità simile a quelladi PCR in un ambiente remoto.

Il piccolo batterio Gram-negativi Coxiella burnetii è l&#39;agente eziologico della febbre Q, che è una zoonosi in tutto il mondo. A causa della distribuzione a livello mondiale di febbre Q e l&#39;alta infettività di C. burnetii, militari e civili personale statunitense dispiegate all&#39;estero sono a rischio di infezione nelle zone endemiche. La febbre Q si manifesta in due forme: infezioni acute e croniche. Acuta febbre Q si presenta con sintomi simil-influenzali, l&#39;epatite, o polmonite, ed è di solito una malattia autolimitante con un basso tasso di mortalità. Cronica febbre Q, mentre meno diffuso, si traduce spesso in endocardite, che ha un tasso di mortalità molto più alto se non trattata 1,2. Pertanto, la diagnosi precoce per guidare un trattamento appropriato è fondamentale per la cura del paziente. Reazione a catena della polimerasi (PCR) e in tempo reale PCR quantitativa (qPCR) test sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Sia PCR e qPCR sono costose e spesso non facilmente disponibili in aree con risorse limitate per il lavoro di routine. Originariamente descritto da Notomi 6, l&#39;amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) offre un metodo alternativo amplificazione del DNA. LAMP utilizza polimerasi Bst DNA per la sintesi del DNA filone spostamento lungo con i set di primer appositamente progettati che riconoscono almeno sei regioni indipendenti del gene bersaglio. Il vantaggio più significativo di LAMP è che l&#39;amplificazione avviene in condizioni isoterme. Pertanto, è necessario solo un bagno d&#39;acqua, blocco di riscaldamento o di un incubatore. Questo metodo è stato utilizzato per rilevare diversi patogeni rickettsie 7-9. Visualizzazione dei prodotti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel è il metodo più accurato che può differenziare i veri positivi da falsi positivi a causa di amplificazione non specifica. Tuttavia le procedure necessarie per elettroforesi su gel non sono pratici per ar risorse limitateEAS. Diversi metodi alternativi sono stati sviluppati per rilevare i prodotti di reazione. Queste alternative, come torbidità derivante dalla formazione di magnesio pirofosfato 10 o utilizzando un colorante intercalante fluorescente da visualizzare sotto luce UV 11,12 sono più favorevoli di esecuzione di un gel. I reagenti LAMP erano stabile per un mese se conservato a 25 ° C e 37 ° C, che sono temperature ambientali nei paesi tropicali e sub-tropicali, dove la febbre Q è endemica 13. Un test LAMP stato sviluppato nel nostro laboratorio per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di plasma 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la preparazione della miscela di reazione LAMP dai reagenti liofilizzati. I reagenti liofilizzati sono stabili per un mese se conservati a RT. Quando combinato con un metodo di visualizzazione facile, questo è un metodo ideale da utilizzare per la rilevazione C. burnetii in un ambiente risorse limitate.

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, salt free</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 units/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>Lyophilized reagents</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tube scanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detection</td></tr></tbody></table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Coxiella burnetii, l&#39;agente che causa la febbre Q, è un batterio intracellulare obbligato. Saggi diagnostici basati sulla PCR sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici. PCR richiede attrezzature specializzate ed estesa formazione degli utenti finali, e quindi non è adatto per il lavoro di routine specialmente in una zona risorse limitate. Abbiamo sviluppato un saggio loop-mediata di amplificazione isotermica (LAMP) per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di pazienti. Questo metodo viene effettuata ad una sola temperatura di circa 60 ° C in un bagnomaria o riscaldamento. La sensibilità di questo test LAMP è molto simile a PCR con un limite di rilevazione di circa 25 copie per reazione. La relazione descrive la preparazione della reazione con reagenti liofilizzati e visualizzazione dei risultati usando blu di idrossinaftolo (HNB) o una lampada UV con colorante fluorescente intercalante nella reazione. I reagenti LAMP erano lyophilized e conservato a temperatura ambiente (RT) per un mese senza perdita di sensibilità di rilevazione. Questo test è particolarmente robusta LAMP perché la preparazione della miscela di reazione non comporta complessi passaggi. Questo metodo è ideale per l&#39;utilizzo in ambienti con risorse limitate, dove la febbre Q è endemica.

I reagenti LAMP liofilizzati all&#39;interno del tubo 0,2 ml contiene polimerasi Bst DNA, primer, e dNTP. 20 microlitri di tampone di ricostituzione è usato per risospendere i reagenti liofilizzati. La Figura 1 mostra i risultati di reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati. Il reagente liofilizzato non riduce la sua attività. Reazioni LAMP preparati da entrambi i reagenti in grado di rilevare 25 copie del DNA stampo. Figura 2 mostra la rilevazione dei prodotti di reazione con HNB o colorante fluorescente intercalante presenti nella reazione. Aggiunta di HNB alla reazione produce un cambiamento di colore visiva dal viola al blu con 25, 50 e 100 copie di DNA stampo presenti nelle reazioni. L&#39;inclusione di colorante intercalante fluorescente nella reazione mostra un segnale di fluorescenza forte con la luce UV quando 25, 50, e 100 copie di modelli di DNA sono presenti. Uno scanner tubo è stato usatoin questo studio per il rilevamento in tempo reale. Questa macchina in grado di eseguire 8 reazioni simultaneamente. La figura 3 mostra l&#39;utilizzo dello scanner tubo di monitorare i segnali di fluorescenza in tempo reale con fluorescente presenza colorante intercalante. I segnali di fluorescenza sono sopra il basale dopo 14, 18, ​​21, e 23 min con 10 6, 10 4, 10 3, e 100 copie di DNA stampo nelle reazioni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig1.jpg" /> Figura 1. LAMP Risultati su agarosio gel con i reagenti appena preparati (A) e liofilizzati reagenti (B). Miscele di reazione sono state incubate a 60 ° C per 60 min. (A) Corsia 1, 100 bp ladder; Corsia 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 e 8 - 9 sono reazioni con 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, e copie di DNA plasmidico. (B) Corsia 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15 e 16 - 17 sono reaZIONI con 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10 e 0 copie di DNA plasmide. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53839/53839fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig2.jpg" /> Figura 2. metodi per rilevare LAMP prodotti. HNB (A) o colorante intercalante fluorescente (B) sono stati usati per individuare i prodotti LAMP. Le reazioni sono state effettuate a 60 ° C per 60 min. Corsia 1 a 5, reazioni con 0, 10, 25, 50, e 100 copie di plasmide. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53839/53839fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig3.jpg" /> Figura 3. </strong&gt; rilevazione in tempo reale di LAMP prodotti. Le reazioni sono state effettuate a 60 ° C per 60 min. Reazioni con 10 6 (nero), 10 4 (rosso), 10 3 (verde), 100 (giallo), 10 (blu), 1 (arancione) e 0 (marrone e marrone chiaro) copie del plasmide. Tre i rilevamenti sono stati eseguiti in modo indipendente. Erano altamente riproducibile. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53839/53839fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.4K Views.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Video: The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Ricerca

Ambiente

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

Profiling anticorpi Systems Immunoprecipitazione luciferasi (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Biologia

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Immunologia e infezioni

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Bioingegneria

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Diagnosi delle infezioni batteriche respiratorie umane mediante amplificazione isotermica

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

Autore in primo piano: Miglioramento del rilevamento rapido dei patogeni respiratori mediante chip microfluidico 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di

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Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Profiling anticorpi Systems Immunoprecipitazione luciferasi (LIPS)

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico